一種以armored RNA作為報告基團超靈敏的實時免疫RT-PCR方法的建立.pdf

1、本文研究目的：構建原核表達系統(tǒng)，表達內含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌體衣殼蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶(RNase)特性，使其替代酶免檢測中酶的顯色反應，通過RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈式反應)來提高對表面抗原(HBsAg)檢測的靈敏度。 研究方法：采用一種稱為免疫-RT-PCR(IRTPCR)的逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)報告系統(tǒng)對蛋白抗原進行檢測，首先構建原核表達

2、系統(tǒng)，表達內含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒，擬選用5′-UTR區(qū)作為MS<,2>噬菌體的包裝序列，引物5，端引入HindⅢ酶切位點。與用HindⅢ酶切的表達載體pNCCL1相連接，構建一新的表達載體pNCCL1-HCV。在IPTG誘導下，衣殼蛋白會在攜帶有pET-MS<,2>-HCV的細菌中表達，并與reRNA組裝成病毒樣顆粒。在immuno-RT-PCR這個反應體系中，包裹特定RNA的重組MS<,2>噬菌體顆粒與傳統(tǒng)ELIS

3、A中和特異抗體相連的報告基團相似，同樣可以形成三明治夾心復合物，通過加熱使結合在固相的armored RNA裂解，釋放出特異的RNA，可以通過RT-PCR 進行檢測。 研究結果：本研究得到的表達載體pET-MS<,2>-HCV及原核表達系統(tǒng)，可以作為構建和制備耐RNase的HCV RNA標準品和質控品的平臺。通過RT-PCR可以提高免疫檢測的靈敏度。采用HBsAg作為三明治夾心中的待測抗原進行實時免疫RT-PCR，與傳統(tǒng)的酶聯免

4、疫吸附實驗相比，檢測的靈敏度提高了10000至100000倍。可以用不同的armored RNA采用多重實時RT-PCR 的方法同時檢測多種不同的靶抗原。這種方法可以作為一種新的超靈敏的免疫檢測方法應用于臨床診斷以及科研。 研究結論：成功構建得到了質粒驅動的包裝系統(tǒng)，經原核表達得到了內含HCV reRNA的病毒樣顆粒。成功的進行了病毒樣顆粒與單克隆抗體的交聯，得到了能夠用于檢測的mAb-armored．RNA的結合物，從而使對H