酵母催化不對稱還原2’-氯-苯乙酮及相關酶的克隆表達.pdf

1、手性化合物由于其獨特的光學活性，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)藥等領域，隨著對不同光學異構體藥物藥理作用的研究進展和對外消旋藥物申報和使用的種種限制，手性藥物成為近年來研究的熱點和方向。光學純醇類化合物是手性藥物合成的重要中間體。利用微生物或其細胞內的氧化還原酶催化潛手性酮的不對稱還原已成為制備高光學純度手性醇的重要方法。本文以2’-氯-苯乙酮作為模型底物，研究了水相中酵母全細胞催化芳香酮類化合物不對稱還原反應的特性，并通過條件優(yōu)化提高

2、了反應效率，強化了反應過程。從酵母細胞內分離純化出具有不對稱催化能力的氧化還原酶——羰基還原酶(CAR)，并通過基因重組技術，構建了能有效表達羰基還原酶基因的重組大腸桿菌。在重組CAR不對稱還原2’-氯-苯乙酮的過程中，通過底物耦聯(lián)體系，成功地實現(xiàn)了輔酶NADH的原位再生。工作的主要內容包括： (1)從實驗室保存的七株酵母菌株中篩選出高效高選擇性還原2’-氯-苯乙酮為(S)-2’-氯-苯乙醇的酵母Candida pseudotr

3、opicalis 104(C.104)。研究了助溶劑乙醇含量對酵母還原產(chǎn)率的影響，比較了不同的水/有機溶劑兩相反應體系中的還原效率，最后選擇了無助溶劑的單一水相中酵母細胞催化還原高濃度2’-氯-苯乙酮作為反應體系。不溶性底物在振蕩的狀態(tài)下呈微小液滴狀分散于緩沖液中。在加入20 g/L的葡萄糖作為輔助底物時，20 g<,DCW>(dry cell weight，細胞干重)/L的酵母可將19.48mmol/L的2’-氯-苯乙酮完全轉化，反應

4、初速度達到33.27 mmol/(h·g<,DCW>)，反應體系中的b/s(生物催化劑與底物質量之比：酵母細胞干重g<,DCW>/底物質量g)值為6.7。酵母細胞在短時間內可耐受高達233.8 mmol/L(約36g/L)的底物濃度，反應24小時產(chǎn)物濃度可達58.4 mmol/L。24小時以后，高濃度的底物和產(chǎn)物均會令酵母細胞失去活性甚至死亡。但在較低底物濃度(6.49 mmol/L)條件下，酵母細胞的耐受性提高，可以多次重復使用，使用

5、16次以后產(chǎn)率仍能達到100％。 (2)對酵母細胞進行超聲波破碎，提取出粗酶液，經(jīng)過DEAE離子交換層析和Blue sepharose藍色瓊脂糖親和層析分離后，獲得了電泳純的的羰基還原酶(CAR)。最終酶活回收達到22.4％，比活力為15.8 U/mgPr，純化倍數(shù)為2980倍。純化的CAR表現(xiàn)出了比酵母細胞更高的催化選擇性，產(chǎn)物S構型2’-氯-苯乙醇的對映體過剩(e．e.)值達到100％。 (3)對純化的羰基還原酶的酶

6、學性質作了研究，該酶以NAD(H)為輔酶，可以不對稱催化酮的還原及相應醇的氧化反應。酶的最適溫度為50℃，催化氧化反應的最適pH為8.5，催化還原反應的最適pH在6.0到6.5之間。CAR的熱穩(wěn)定性較差，在30℃以上時酶蛋白迅速變性失活；酶蛋白對環(huán)境pH的變化比較敏感，僅在pH值7.0至8.5之間較為穩(wěn)定。多數(shù)金屬離子對酶催化具有抑制作用，EDTA的加入對酶活的影響不明顯。CAR具有廣泛的底物特異性，可以催化還原多種芳香族和脂肪族酮類化

7、合物，以及相應醇類的氧化反應。反應結果顯示，羰基還原酶對還原底物的活力大小受到羰基附近位阻效應和電荷誘導效應的雙重影響，但以位阻效應為主要影響因素。羰基還原酶對芳香酮類化合物具有很高的立體選擇性，對苯乙酮、2’-氯-苯乙酮、3’-氯-苯乙酮、4’-氯-苯乙酮、3-氯-1-苯丙酮和2-氯-2’，4’-二氟苯乙酮還原產(chǎn)物的e．e．值都達到100％，其反應方式遵循Prelog反應規(guī)則。 (4)從酵母C.104中成功擴增得到CAR基因片斷，連接

8、到表達質粒pET28a(+)中，構建得到重組菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CAR)。經(jīng)過IPTG誘導表達，其比活達到0.24 U/mgPr，為酵母C.104(0.0053 U/mgpr)的40多倍。利用Ni-NTA Agarose親和層析，從重組菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CAR)中純化出了重組CAR，重組CAR與酵母細胞中分離出的CAR具有相同的酶學性質。用相同的引物分別從酵母Saccharo

9、myces cerevisiae B5、Candida utilis 1257、Pichia membranaefaciens和Saccharomyces cerevisiae 4742中擴增出與CAR基因序列相同的基因片段，說明CAR基因在多種酵母細胞中存在，具有高度的保守性。 (5)應用重組CAR不對稱催化還原2’-氯-苯乙酮，通過加入異丙醇或仲丁醇作為輔助底物，建立了底物耦聯(lián)反應體系實現(xiàn)輔酶NADH原位再生的反應體系。對反