亞成體大熊貓腸道真菌多樣性的初步研究.pdf

1、大熊貓屬我國(guó)瀕危珍稀動(dòng)物，其腸道正常菌群是維持大熊貓腸道微生態(tài)系平衡的一群微生物，它們與宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝、免疫及發(fā)育等方面緊密相關(guān)。因腸道菌群失調(diào)造成其微生態(tài)失衡而引起一系列腸道疾病是大熊貓致死的主要原因之一。腸道微生物中大部分是細(xì)菌，也有一些真菌。目前，對(duì)大熊貓腸道微生態(tài)的研究大部分見于細(xì)菌多樣性方面，未見運(yùn)用分子生物學(xué)方法針對(duì)其腸道真菌多樣性的研究。[目的]分析5只亞成體大熊貓腸道真菌的多樣性。[方法]采用基于ITS基因的RFLP(

2、RestrictionFragment Length Polymorphism)方法，對(duì)腸道真菌總DNA進(jìn)行ITS-RFLP分析，構(gòu)建ITS克隆文庫(kù)，然后用HhaⅠ、HaeⅢ進(jìn)行酶切指紋圖譜分析，測(cè)序并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。[結(jié)果]研究表明:
　　(1)從轉(zhuǎn)化的平板上隨機(jī)挑取120個(gè)克隆進(jìn)行分析，CT、YY、YX、ZM、XN分別獲得105、113、107、101、106個(gè)陽性克隆子，陽性率分別為87.5％、94.2％、89.2％、84.

3、2％、88.3％。用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ和HaeⅢ對(duì)陽性克隆子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切片段大小和數(shù)量對(duì)條帶圖譜分型，結(jié)果表明在CT、YY、YX、ZM、XN的腸道ITS文庫(kù)中分別分出27、27、18、31、27個(gè)OTUs。對(duì)其進(jìn)行多樣性分析，構(gòu)建的文庫(kù)覆蓋率均在80％以上，表明所構(gòu)建的文庫(kù)涵蓋了亞成體大熊貓腸道的大部分真菌種類;物種豐富度指數(shù)(E)均在0.25左右，香農(nóng)指數(shù)(H')均在2.57左右，辛普森指數(shù)(D)均在0.11左

4、右，表明亞成體大熊貓腸道真菌的多樣性信息比較豐富;Pielou均勻度指數(shù)（Jsw）均在0.79左右，表明亞成體大熊貓腸道真菌群落分布的均勻度較好;根據(jù)Chaol物種多樣性指數(shù)(SChaol)預(yù)測(cè)，亞成體大熊貓腸道大概有23～67類真菌。
　　(2)將CT、YY、YX、ZM、XN文庫(kù)中屬于同一個(gè)OUT的克隆隨機(jī)選一個(gè)代表菌進(jìn)行測(cè)序，去除載體序列，將所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性檢索，選取相似度最高的序列。結(jié)果顯示，5

5、只亞成體大熊貓腸道真菌主要由Ascomycota(平均占46.24％)、Basidiomycota（平均占15.79％）兩個(gè)門和一些未分類(平均占29.14％)、未培養(yǎng)（平均占8.83％）的真菌。其中，Ascomycota主要以Saccharomycetes（平均占63.74％）和Dothideomycetes（平均占35.91％）兩個(gè)綱為主;Basidiomycota主要以Tremellomycetes（平均占65.80％）和Micr

6、obotryomycetes（平均占33.15％）兩個(gè)綱為主。而這四個(gè)綱分別則主要以Candida、Debaryomyces; Pleosporales、Myriangium; Cystofilobasidium、Trichosporon; Leucosporidium、Leucosporidiella八個(gè)菌屬為主，各樣品中所占比列不等。[結(jié)論]亞成體大熊貓腸道內(nèi)存在一定比例的真菌菌群，且ITS-RFLP技術(shù)能夠很好的對(duì)其多樣性進(jìn)行分析