VEGF分別與bFGF、aFGF聯(lián)合誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞.pdf

1、種子細胞的選擇是進行細胞組織工程研究的基礎(chǔ)。胚胎干細胞作為一種全能干細胞，是最理想的種子細胞，但是在獲取胚胎干細胞的過程中需要破壞囊胚，存在倫理學爭議，并且將胚胎干細胞移植入個體后會引起免疫排斥并導致畸胎瘤，因而限制了它在科研和臨床中的應用。
　　 隨著研究的深入，學者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞不存在以上問題，逐漸成為細胞組織工程研究的熱點。首先，間充質(zhì)干細胞是一種起源于中胚層間質(zhì)的成體干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體

2、外環(huán)境下可以向多種細胞分化，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等，并且經(jīng)過體外傳代擴增以后仍然能夠保持這種干細胞特性。其次，間充質(zhì)干細胞的來源廣泛，在胎兒及成體的骨髓、骨膜、脂肪、乳牙、臍帶等多種組織中均有存在，分離獲取間充質(zhì)干細胞不需要破壞囊胚，因而不存在倫理道德問題。再者，間充質(zhì)干細胞還具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以通過細胞間的相互作用及產(chǎn)生細胞因子抑制T細胞的增殖及其免疫反應，從

3、而發(fā)揮免疫重建的功能，進行自體移植也不存在免疫排斥反應，并且已經(jīng)有許多研究結(jié)果顯示成體干細胞治療不會引發(fā)畸胎瘤。
　　 間充質(zhì)干細胞在骨髓中含量最高，但也僅占有核細胞的0.001％-0.01％。目前分離間充質(zhì)干細胞的方法主要有:全骨髓貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠法，前兩種方法操作簡便，但僅用其中一種方法很難實現(xiàn)細胞的純化，從而對實驗研究產(chǎn)生不良的影響，后兩種方法分離出來的細胞純度較高，但操作過程復雜，費

4、用昂貴，不能得到廣泛推廣。目前多采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞，但這種方法分離出來的間充質(zhì)干細胞的純度如何，細胞經(jīng)過傳代以后的活力是否發(fā)生變化，目前缺乏較為系統(tǒng)而全面的評估。
　　 體內(nèi)、外的許多研究顯示間充質(zhì)干細胞可以分化為血管內(nèi)皮細胞，其中血管內(nèi)皮細胞生長因子在此過程中發(fā)揮主要作用，堿性成纖維細胞生長因子可以創(chuàng)造有利于間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化的微環(huán)境，具有協(xié)同誘導的作用，這兩種因子是目前體外

5、內(nèi)皮化誘導最常用的組合。酸性成纖維細胞生長因子與堿性成纖維細胞生長因子的生物學功能相似，并且在酸性環(huán)境中其生物活性發(fā)揮的更好。在誘導分化過程中，細胞代謝會引起培養(yǎng)液的PH值降低，酸性成纖維細胞生長因子有可能更好的協(xié)助血管內(nèi)皮細胞生長因子誘導間充質(zhì)干細胞可以分化為血管內(nèi)皮細胞。
　　 第一章:兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及活力檢測
　　 目的：
　　 體外分離出兔骨髓間充質(zhì)干細胞，進行形態(tài)學、細胞表型及分化潛

6、能的鑒定，并對傳代后細胞的活力進行檢測和比較。
　　 方法：
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、純化:在無菌條件下抽取兔子股骨和脛骨的骨髓，采取密度梯度離心的方法把骨髓中比重不同的細胞群分層，然后分離出含有骨髓間充質(zhì)干細胞的單個核細胞，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，通過換液去除未貼壁的細胞，并且在傳代過程中利用骨髓間充質(zhì)干細胞易于消化的特點，嚴格控制胰蛋白酶的量和消化時間，去除貼壁能力較強的單核細胞

7、及成纖維細胞，從而實現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞的純化。
　　 2、骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定:
　　 (1)形態(tài)學:倒置顯微鏡下觀察細胞在不同時期的形態(tài)特征，并進行蘇木素—伊紅染色。
　　 (2)細胞表型:應用流式細胞儀檢測CD14、CD29、CD34、CD44、CD45以及CD90的表達。
　　 (3)分化潛能:應用成骨誘導培養(yǎng)液誘導間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞，并進行茜素紅染色鑒定鈣質(zhì)結(jié)節(jié);應用成脂誘導培養(yǎng)液誘導間

8、充質(zhì)干細胞分化為脂肪細胞，并進行油紅0染色鑒定脂肪細胞。
　　 3、細胞活力的檢測
　　 (1)描繪細胞生長曲線:選取P1、P3、P5代生長狀況良好的細胞以相同細胞數(shù)量接種于直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，自第2d起每天取3個培養(yǎng)皿消化計數(shù)，每皿計數(shù)3次，取其平均值，連續(xù)8d。以時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸，繪制生長曲線。
　　 (2)計算細胞接種存活率:選取P1、P3、P5代處于對數(shù)生長期的細胞，以3.5×107 L

9、-1的濃度接種于直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿中，每隔2h隨機選取3個培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液與未貼壁細胞，用濃度為0.25％胰蛋白酶消化，計算每個皿內(nèi)的細胞數(shù)量，取平均值，計算貼壁率，連續(xù)測定18 h，以時間為橫軸，貼壁率為縱軸，繪制曲線。
　　 (3)細胞克隆形成率:選取P1、P3、P5代處于對數(shù)生長期的細胞，消化后以100個/孔接種于6孔板中，連續(xù)培養(yǎng)16 d，用臺盼藍染色后計數(shù)細胞克隆，標準為:細胞數(shù)≥50個記為為1個細胞克隆。<

10、br>　　 結(jié)果：
　　 1、形態(tài)特征:細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長，原代細胞的形態(tài)多呈圓形、梭形和三角形，5-6 d可形成散在的細胞集落，8-10 d集落之間相互融合，細胞呈魚群狀排列。經(jīng)過貼壁篩選，細胞的同質(zhì)性和均一性逐漸提高。
　　 2、細胞表型:流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:細胞CD29、CD44、CD90的表達率分別為97.21％、98.87％和96.20％; CD14、CD34、CD45表達率分別為5.36％、0.36

11、％和2.03％。
　　 3、分化潛能:成骨誘導21 d，實驗組可形成明顯的鈣質(zhì)結(jié)節(jié)，茜素紅染色后見鈣結(jié)節(jié)呈深紅色，對照組無明顯改變。成脂誘導14 d，實驗組細胞呈圓形或多邊形，細胞質(zhì)內(nèi)可見明顯脂滴形成，油紅(O)染色呈現(xiàn)鮮艷的紅色，對照組未見明顯變化。
　　 4、生長曲線:P1、P3代細胞的生長曲線形態(tài)相似，均呈現(xiàn)出典型的“S”形，相同時間內(nèi)P5代細胞的增殖速度相對緩慢。
　　 5、細胞接種存活率:P1、P3代細

12、胞貼壁率的變化基本一致，接種14h后貼壁率可達到96％，P5代細胞的貼壁率較P1、P3代細胞明顯低，接種14h后的貼壁率僅為87％，統(tǒng)計分析提示P1、P3代細胞貼壁率的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，P5代細胞與P1、P3代細胞之間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 6、細胞克隆形成率:P1、P3、P5代細胞均可形成細胞克隆，顯微鏡下可見克隆內(nèi)的細胞排列緊密，形態(tài)與原代細胞近似，克隆周邊可見散在的老化或變異的細胞。細胞

13、克隆形成率在P1、P3、P5代細胞之間的差異具有顯著性(P＜0.01)，隨著傳代次數(shù)增加克隆形成率逐漸降低。
　　 結(jié)論：
　　 1、密度梯度離心法能夠分離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)過貼壁篩選可以實現(xiàn)細胞的進一步純化。
　　 2、密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選的方法分離出的骨髓間充質(zhì)干細胞在P1至P3代能夠保持良好的細胞活力;隨著擴增傳代，細胞活力會有不同程度的下降。
　　 3、基于骨髓間充質(zhì)干細

14、胞的組織工程研究適宜在P1至P3代以內(nèi)進行，這樣能夠保證細胞與支架的良好貼附，為進一步的臨床治療奠定基礎(chǔ)。
　　 第二章:誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞:aFGF與bFGF生物活性的比較
　　 目的：
　　 VEGF分別與bFGF、aFGF聯(lián)合誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞，通過細胞形態(tài)學、攝取功能、檢測CD31表達率及NO分泌量鑒定血管內(nèi)皮細胞，并統(tǒng)計分析兩種因子組合在誘導效率方面的差異。

15、>　　 方法：
　　 1、兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定:同第一部分。
　　 2、誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞:選取P3代生長狀況良好的細胞，接種于6孔板中。實驗組應用含VEGF(20ng/ml)、aFGF(10ng/ml)的培養(yǎng)液誘導，對照組應用含VEGF(20ng/ml)、bFGF(10ng/ml)的培養(yǎng)液誘導。
　　 3、血管內(nèi)皮細胞的鑒定
　　 (1)在倒置顯微鏡下觀察誘導前后細胞

16、的形態(tài)變化。
　　 (2)攝取功能:采用攝取Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和結(jié)合硫氰酸熒光素標記的結(jié)合荊豆凝集素(FITC-UEA-1)的雙染色方法進行鑒定。熒光顯微鏡下觀察，攝取Dil-ac-LDL的細胞散發(fā)出紅色熒光，結(jié)合FITC-UEA-I的細胞散發(fā)出綠色熒光，熒光染色雙陽性的細胞呈黃色，是具有攝取功能的內(nèi)皮細胞。
　　 (3)CD31表達率:兩種因子組合誘導培養(yǎng)第15d和第24 d，應用流

17、式細胞儀檢測細胞表面CD31的表達。
　　 (4)NO分泌量的檢測:誘導第15d和第24 d，取上清液，儲存于-80℃冰箱內(nèi)。按照NO檢測試劑盒的說明書進行操作，以平均吸光度OD值為x軸，標準品濃度為y軸，用Excel作圖得到標準曲線公式，將樣品OD值代入公式計算NO濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)及鑒定:同第一部分。
　　 2、內(nèi)皮細胞鑒定
　　 (1)形態(tài)學觀察:經(jīng)過誘導以

18、后，細胞體積變小，形態(tài)為圓形、橢圓形或短梭形，形態(tài)飽滿，立體感增強。24 d后，細胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)。
　　 (2)攝取功能:誘導的細胞經(jīng)過熒光染色，顯微鏡下可見雙染色陽性的細胞大于50％。
　　 (3)CD31的表達:誘導第15d，實驗組和對照組CD31的表達率分別為(34.20±2.90)％和(46.23±2.87)％，兩樣本t檢驗比較差異具有顯著性(P＜0.01)，對照組的表達率較高;誘導第24 d，實驗

19、組和對照組CD31的表達率分別為(53.35±2.12)％和(56.14±3.93)％，兩樣本t檢驗比較差異沒有顯著性(P＞0.05)。
　　 (4)NO分泌量的檢測:誘導第15 d，實驗組和對照組NO的分泌量分別為(70.27±3.45)μmol/L和(79.19±5.34)μmol/L兩樣本t檢驗比較差異具有顯著性(P＜0.01)，對照組NO的分泌量較高;誘導第15d，實驗組和對照組NO的分泌量分別為(105.16±5.89