基于P48重組蛋白的牛支原體抗體檢測技術研究.pdf

1、牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）是感染牛的一種致病性病原體，主要引起牛乳腺炎、肺炎、關節(jié)炎、中耳炎，也可引起角膜炎、結膜炎等疾病，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經濟損失。2008年，我國首次報道了M.bovis引起的犢牛傳染性肺炎，并造成了很大損失。目前，牛支原體感染已成為危害我國養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病之一。但我國迄今尚無特異、敏感的M.bovis抗體檢測試劑，缺乏有效的流行病學技術手段，這給牛支原體病的預防控制帶來了困

2、難。本研究利用牛支原體P48重組蛋白，建立了檢測M.bovis抗體的間接血凝試驗方法和膠體金免疫層析試紙條，并完成了試劑盒組裝、實驗室試制和質量研究，為牛支原體病的診斷和流行病學調查提供了有效工具，對本病的預防控制具有重要意義。
　　本研究第一部分為M.bovis抗體的間接血凝試驗方法和膠體金免疫層析試紙條檢測方法的建立。在參考文獻的基礎上，優(yōu)化并合成牛支原體的p48基因，克隆到pET32a(+)表達載體上后，轉化大腸桿菌BL21

3、(DE3)，16℃低溫長時間誘導，獲得部分可溶性表達的P48重組蛋白。經Western-blot檢測，純化的P48重組蛋白能與M.bovis高免血清發(fā)生特異性反應，具有良好的反應原性。
　　以純化的P48重組蛋白致敏醛化-鞣酸化的綿羊紅細胞，建立了檢測牛支原體抗體的間接血凝試驗方法(IHA)。P48重組蛋白致敏紅細胞的最佳濃度是20～40μg/mL，M.bovis高免血清抗體效價達1∶211。該方法對牛肺疫、牛巴氏桿菌病、牛病毒性

4、腹瀉病、布氏桿菌病、結核病、口蹄疫、牛生殖道支原體感染、里奇氏支原體感染、大腸桿菌病陽性血清檢測均為陰性。分析特異性為100％，分析敏感性為93.33％。與國外商品化的ELISA試劑盒比較，平均符合率為96.15％。對833份田間血清和1084份乳清進行檢測，陽性率分別是15.37％和19.56％。結果表明，該方法敏感性高、特異性強和重復性好，可用于牛支原體抗體水平檢測、牛支原體病的輔助診斷和流行病學調查。
　　利用合適粒徑的膠體

5、金顆粒在pH7.4條件下標記6μg/mL P48重組蛋白作為金標抗原包被金標墊、山羊抗牛IgG(H+L)二抗包被檢測線（T線）、兔抗P48重組蛋白IgG多抗包被質控線(C線)，組裝成膠體金免疫層析試紙條(ICS)。該試紙條檢測M.bovis高免血清，效價可至1∶106。檢測上述相近病原或者類癥病原陽性血清，不發(fā)生交叉反應。與IHA方法相比，陽性符合率為93.57％，陰性符合率為93.02％，平均符合率為96.53％。檢測臨床血清200份