ERK1-2磷酸化在哮喘小鼠氣道黏液高分泌中的作用.pdf

1、第一部分哮喘小鼠模型的制備
　　 目的：建立哮喘小鼠模型并觀察小鼠氣道炎癥及氣道黏液分泌的情況。
　　 方法：清潔級(jí)BALB/c雄性小鼠20只隨機(jī)分為兩組：生理鹽水對(duì)照(NS組)和哮喘組(AS組)，各10只。AS組于第1、13天腹腔注射卵清白蛋白(OVA)致敏，第19天開(kāi)始霧化吸入5％OVA溶液30min，連續(xù)激發(fā)5天，制備哮喘小鼠模型，NS組以生理鹽水代替OVA，處理方法同AS組。測(cè)定各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF

2、)細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BALF中IL-5和IL-32水平，阿爾辛藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫(AB-PAS)染色觀察氣道杯狀細(xì)胞及氣道分泌黏液，HE染色和VG染色觀察肺組織病理學(xué)改變，RT-PCR、免疫組織化學(xué)(IHC)及免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)肺組織中黏蛋白Muc5ac mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：AS組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、

3、IL-5和IL-32水平、肺組織AB-PAS陽(yáng)染面積、Muc5ac mRNA和蛋白表達(dá)均高于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。Western blot檢測(cè)肺組織Muc5ac蛋白的表達(dá)與BALF細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞、IL-32及氣道AB-PAS染色的關(guān)系均呈正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r值分別為0.990，0.979，0.986，0.987，0.992(均P<0.01)，與中性粒細(xì)胞及IL-5的關(guān)系也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r值

4、分別為0.947和0.960(P值分別為0.015和0.01)。
　　 結(jié)論：用OVA致敏和激發(fā)可成功建立較為理想的哮喘小鼠模型，哮喘小鼠出現(xiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道慢性炎癥和氣道黏液高分泌的表現(xiàn)，且二者密切相關(guān)。
　　 第二部分 ERK1/2的磷酸化在哮喘小鼠氣道黏液高分泌中的作用及藥物干預(yù)的影響
　　 目的：觀察地塞米松(dexamethasone)及U0126干預(yù)對(duì)哮喘小鼠肺組織細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(

5、ERK1/2)的磷酸化水平、IL-32及Muc5ac蛋白表達(dá)的影響，探討ERK1/2的磷酸化在支氣管哮喘小鼠氣道黏液高分泌中的作用。
　　 方法：清潔級(jí)BALB/c雄性小鼠50只，隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組(NS組)、哮喘組(AS組)、地塞米松干預(yù)組(AS+DEX組)、U0126干預(yù)組(AS+U0126組)及二甲基亞砜(DMSO)溶劑對(duì)照組(AS+DMSO組)，各10只。各干預(yù)組于霧化激發(fā)前30min腹腔注射藥物干預(yù)，余處理同AS組

6、。測(cè)定BALF中細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，ELISA法檢測(cè)BALF中IL-5和IL-32水平，AB-PAS染色觀察氣道杯狀細(xì)胞增生及氣道黏液分泌的改變，HE染色和VG染色觀察肺組織病理學(xué)改變，RT-PCR檢測(cè)Muc5ac mRNA在肺組織內(nèi)的表達(dá)，IHC和Western blot法檢測(cè)肺組織Muc5ac、ERK1/2、p-ERK1/2及IL-32蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：AS組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)

7、胞計(jì)數(shù)、IL-5、IL-32水平、AB-PAS陽(yáng)性表達(dá)面積、Muc5ac mRNA、Muc5ac、ERK、p-ERK及IL-32蛋白表達(dá)較NS組均增高，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，與AS+DMSO組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；地塞米松和U0126可以抑制ERK1/2的磷酸化，且二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組小鼠Muc5ac mRNA和蛋白表達(dá)與ERK1/2的磷酸化水平呈高度正相關(guān)(r值分別為0.983、0.996，均