DNA甲基化與MeCP2在大鼠肝纖維化中的作用及其分子作用機制研究.pdf

1、肝纖維化是多種慢性致病因素作用于肝臟引起 ECM過量沉積的創(chuàng)傷愈合過程,激活的HSC是產生ECM的主要來源細胞。HSC活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此針對HSC的抗肝纖維化治療成為治療肝纖維化的關鍵步驟。目前針對肝纖維化的治療主要集中于抑制HSC活化及膠原合成、促進膠原降解等幾方面。目前研究發(fā)現DNA甲基化在HSC活化過程中具有重要作用。為了進一步探討DNA甲基化在肝纖維化中的作用機制,應用5-雜氮-2-脫氧胞苷(5-aza-2-de

2、oxycitydine,5-AzadC)作用于HSC,研究其對HSC活化增殖的影響及其分子機制,以揭示更多干預HSC活化的作用靶點。研究主要是從DNA甲基化這個角度進行,以重要的促HSC活化的細胞因子PDGF介導的信號轉導通路為對象,以期為臨床防治肝纖維化提供新方法、新思路。研究內容主要包括以下三個部分:
　　1.RASAL1在大鼠肝纖維化中的表達變化
　　CCl4皮下注射建立大鼠肝纖維化模型,正常組10只、CCl4處理組(

3、3、6、9、12W)各15只。自處理之日開始,除正常組,其他各組雄性大鼠皮下注射50％CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次,共12周;正常組給予同樣劑量花生油皮下注射。12周末,取肝組織進行病理組織學和Masson膠原染色檢測,并檢測RASAL1在大鼠肝組織中的表達變化。實驗結果表明,大鼠肝纖維化模型建立成功。在肝纖維化形成過程中RASAL1表達逐漸降低。
　　2.DNA甲基化抑制劑和MeCP2對HSC-T6細胞活化增殖的影

4、響
　　應用DNA甲基化抑制劑和RNA干擾沉默甲基CpG結合蛋白2(methyl-CpG-binding protein2,MeCP2)以觀察對大鼠肝星狀細胞株HSC-T6細胞增殖的影響。體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞HSC-T6,PDGF-BB10ng/ml刺激細胞24h后,加入不同濃度的5-AzadC溫育48h,MTT法檢測5-AzadC對HSC增殖的影響,RT-PCR方法測定各組α-SMA,CollagenⅠ的mRNA表達水平;同

5、時應用免疫印跡,免疫組化檢測肝組織MeCP2,α-SMA蛋白的表達。根據MeCP2的堿基序列設計并合成小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),通過脂質體LipofectamineTM2000轉染到HSC-T6細胞內,熒光倒置顯微鏡觀察細胞的轉染效率,用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HSC-T6細胞增殖變化;Quantitative Real-Time PCR檢測α-SMA、MeCP2 mRNA的表達;流式

6、細胞術檢測HSC-T6細胞周期的變化;Western Blot檢測α-SMA、MeCP2蛋白的表達。將MeCP2-siRNA轉染進HSC-T6細胞內,MeCP2基因及蛋白水平明顯降低;同時α-SMA基因與蛋白的表達水平亦明顯降低;靶向封閉MeCP2基因的表達可明顯抑制HSC-T6細胞的活化增殖。實驗結果表明,DNA甲基化和MeCP2可能是潛在的治療肝纖維化的治療靶點。
　　3.MeCP2對RASAL1表達的調控作用研究。
　

7、　肝星狀細胞(HSC)活化轉化成肌成纖維化母細胞,分泌ECM是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。前期研究發(fā)現,應用DNA甲基化抑制劑5-AzadC處理肝星狀細胞可阻止其活化增殖,并可促進Ras-GTP酶激活樣蛋白1在肝星狀細胞中的表達。文獻報道,RASAL1甲基化與成纖維細胞活化及肝纖維化的形成密切相關。推測,DNA甲基化促進肝纖維化與RASAL1啟動子發(fā)生甲基化,導致其表達下降有關。為了尋找潛在的分子機制,利用小干擾RNA沉默MeCP2,發(fā)現可