人呼吸道合胞病毒M蛋白非復制型重組腺病毒的構建和鑒定.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)廣泛分布于世界各地，是導致嬰幼兒嚴重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚無特異性防治方法，世界衛(wèi)生組織將發(fā)展RSV疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項目之一。RSV的11種蛋白中，RSV的基質蛋白(matrixprotein，M)是位于病毒包膜內(nèi)側的結構蛋白，在RSV病毒形態(tài)發(fā)生上具有重要作用，同時對宿主細胞的轉錄具有抑制作用。為進一步開展M蛋白

2、的功能研究及尋求RSV疫苗研制的新方法，我們克隆了RSV M基因并完成了可表達RSV M蛋白的非復制型重組腺病毒的構建及鑒定。 方法：根據(jù)編碼M蛋白的基因序列設計引物，通過RT-PCR從感染RSV的HEp-2細胞中擴增獲得M蛋白基因，克隆到pGEM-T Easy載體中，序列測定正確后，將其亞克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，并進行酶切鑒定，脂質體法轉染COS-7細胞，應用Western blotting方法分析M基因表

3、達情況。限制性內(nèi)切酶從pT/M中切下目的基因M，亞克隆至腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV，獲得重組穿梭質粒pSC/M。酶切鑒定后，Pme I線性化pSC/M，利用電穿孔法轉化技術，把線性pSC/M轉入含有pAdEasy-1的大腸桿菌Ecoli BJ5183中進行同源重組，獲得重組腺病毒質粒pFGAd/RSVM。酶切鑒定后，以Pac I酶切pFGAd/RSVM，脂質體法轉染293細胞。待出現(xiàn)典型的細胞病變效應(cytopathic

4、effect，CPE)后，取細胞裂解液，以Western blotting鑒定目的基因表達。 結果：重組表達載體pcDNA3.1(+)/M的限制性內(nèi)切酶分析結果與預期一致，基因序列分析顯示RSV M基因沒有發(fā)生無義突變。轉染COS-7細胞后，Western blotting分析觀察到M蛋白特異性的表達條帶。重組穿梭質粒pSC/M和重組腺病毒質粒pVGAd/RSVM酶切鑒定正確。pFGAd/RSVM以Pac I酶切后，用脂質體法轉