丙型肝炎抗病毒治療失敗中病毒全基因組變異的作用和機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染人體后，75-85％會發(fā)展為慢性丙型肝炎，最終導致肝硬化和肝癌細胞，發(fā)病較隱匿，具有更大的危害性，嚴重影響了人民的生命健康，但目前尚無有效的疫苗預防HCV感染，公認的標準治療方案僅有聚乙二醇干擾素(Peg-IFN)或普通干擾素(IFN)聯(lián)合利巴韋林治療進行為期24周-48周的治療，其費用昂貴，副反應多，療效卻不理想。不同基因型HCV感染者抗病毒療效

2、存在巨大差異，基因1型患者，治療結束達到持續(xù)病毒學應答(SVR)率約為39.8-40.9％；基因2型、3型的感染者持續(xù)病毒學應答率卻能夠達到75-80％。在我國，HCV感染以基因1b型為主，眾多基因1b型丙型肝炎患者在忍受了48周干擾素抗病毒治療的副反應后，卻仍然沒有良好的治療效果，有的在治療過程中反彈(breakthrough)，有的在停藥后復發(fā)(relapse)，有的甚至完全無應答(non-response)。目前普遍認為干擾素抵抗

3、(IFN resistance)的發(fā)生是導致抗病毒治療失敗的重要原因，但其具體機制尚不明確，因此，在丙型肝炎治療的研究中要解決的一個重要問題就是闡明難治性丙型肝炎的發(fā)病機制及應對策略，為丙型肝炎患者抗病毒治療提供療效預測指標，并為改善抗病毒應答療效提供新的思路。
　　 不同HCV基因型患者間抗病毒SVR率的巨大差異直接提示病毒因素在干擾素抗病毒治療中起著重要作用，提示應該著重從病毒因素開展相應研究。盡管已有許多研究表明多個HCV

4、蛋白與干擾素抵抗發(fā)生相關，包括NS5A上的ISDR、PKR-BD、V3、V4和IRRDR，E2上的PePHD、HVR1、HVR2、HVR3，NS4A以及Core，但是目前這些研究都沒有達成一個明確的共識，并且體內(nèi)和體外的研究結果還有許多相互矛盾的結論。抗病毒治療中反彈患者最初對干擾素抗病毒治療應答良好，HCVRNA水平也能降到最低檢測值以下，但卻在治療過程中出現(xiàn)血清HCV RNA復陽，這類患者作為病毒因素的研究對象或許更能排除眾多混雜因

5、素，在這類患者中更易研究HCV基因組變異和進化是否在干擾素抵抗發(fā)生中起任何作用，因為干擾素抵抗的HCV病毒準種株很有可能在治療的過程中被篩選出來。因此，本研究旨在分析和比對這類患者治療前、治療中以及停藥后病毒全長基因組序列變化情況，同時改造和構建新的HCV全長基因組復制子模型在體外驗證并鑒定相關變異干擾素抵抗發(fā)生的確切相關性。
　　 方法：
　　 對接受干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的19例基因1b型慢性丙型肝炎患者的臨床

6、轉(zhuǎn)歸情況進行系統(tǒng)分析，根據(jù)抗病毒療效，選擇具有代表性的一例治療中反彈患者和一例完全無應答患者在停藥后繼續(xù)隨訪至第5年，根據(jù)留取的基線、抗病毒治療第48周(W48)和停藥后第5年(Year5)的病毒血清，通過血清微量HCV RNA抽提技術、長片段PCR擴增和測序技術、HCV全長讀碼框序列的拼接技術等獲得入選2例患者基線、W48和Year5的全長基因組HCV序列，通過Vector NTI軟件和BioEdit軟件比對分析2例患者在治療前、治療

7、中及停藥后病毒基因組的變異和進化情況。根據(jù)比對結果，改造基因1b型HCV全長基因組復制子質(zhì)粒sfl-Conl，引入點突變構建新的酶切位點置換臨床患者體內(nèi)HCV治療前后發(fā)生明顯變異的相關序列，體外轉(zhuǎn)錄后獲得HCV RNA轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細胞系建立含有臨床患者體內(nèi)特異性變異相關序列的復制子細胞模型，通過實時熒光定量PCR檢測體外干擾素處理上述復制子細胞后其胞內(nèi)HCV RNA的變化。
　　 結果：
　　 19例基因1b型

8、慢性丙型肝炎患者接受普通干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的應答情況，SVR率為47.7％(9/19)，經(jīng)過48周的抗病毒治療，治療后肝臟炎癥壞死評分(HAI)明顯降低，以達到SVR的患者最為明顯(P=0.039)。
　　 抗病毒治療期間，在治療反彈患者中，整體HCV讀碼框的核苷酸水平的變異率為1.97％，氨基酸水平為1.43％，明顯高于無應答患者(核苷酸水平為0.74％，氨基酸水平為0.40％)。在治療中反彈患者中基線與48周的比較

9、，HCV功能蛋白P7和NS2區(qū)域的變異率最高(P7蛋白，核苷酸水平為5.82％，氨基酸水平為4.76％；NS2蛋白，核苷酸水平為4.45％，氨基酸水平為3.69％)。在治療中反彈患者中，A-B-B和A-A-B類型是主要的變異類型，分別占47.14％和40.0％，A-B-C類型最少，占1.43％。在無應答患者中，A-A-B變異類型最多，占67.57％。
　　 體外干擾素處理復制子細胞結果表明，轉(zhuǎn)入反彈患者治療后p7-NS2片段的復

10、制子HCV RNA，在干擾素濃度分別為10u/ml和100u/ml時均較轉(zhuǎn)入治療前p7-NS2片段的復制子中HCV RNA相對含量更高(P=0.003，P=0.0023)。
　　 結論：
　　 基因1b型慢性丙型肝炎接受普通干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，雖然抗病毒治療達到持續(xù)病毒學應答率有限，但仍能夠有效改善肝臟組織炎癥壞死程度。
　　 在干擾素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒治療期間，完全無應答患者體內(nèi)丙型肝炎病毒的變異率

11、較低，而治療中反彈患者較易發(fā)生變異，以p7和NS2變異率最高，并且在治療過程中發(fā)生的變異在停藥后多數(shù)能夠保留下來，提示這些變異可能對病毒適應性影響不大。
　　 基因1b型HCV全基因組復制子sfl-Conl體外轉(zhuǎn)錄后經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細胞系后能夠構建有效的HCV體外復制子細胞模型，該模型HCV克隆中置換入臨床來源的p7-NS2片段后仍能在Huh-7.5.1細胞中有效復制。
　　 體外干擾素處理實驗表明，抗病毒