雞弓形蟲致密顆粒蛋白截短基因sGRA8的克隆表達及ELISA診斷方法的建立.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的世界性分布人畜共患寄生蟲病，人和動物的感染率都很高，嚴重危害人類健康，對孕婦和免疫缺陷、免疫抑制患者的損害尤甚，并給世界各國的畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失。國內散養(yǎng)雞群中的弓形蟲病感染不容忽視，平均在30％左右。人類通過接觸病雞或食用未煮熟的雞可感染弓形蟲，因此加強對雞弓形蟲感染的檢測，對防控弓形蟲病及人類健康有著重要的公共衛(wèi)生學意義。

2、>　　目前，對畜禽弓形蟲感染的檢測手段主要有病原學診斷、免疫學診斷和核酸檢測技術三類。ELISA法具有靈敏性高、特異性高、重復性好等特點，且對檢測設備要求不高，是一種優(yōu)良的檢測手段。市場上銷售的檢測雞弓形蟲抗體的ELISA試劑盒特異性差、抗體檢出時間短，對感染后期的抗體無法檢出。近些年在國內外，關于豬、牛、羊等家畜動物弓形蟲感染及抗體檢測技術的研究和報道較多，但對雞等禽類弓形蟲感染檢測的研究較少。
　　本實驗室對GRA8全基因進行

3、了克隆表達，并進行了Western blot和ELISA驗證，表明GRA8是一種具有很好診斷價值的雞弓形蟲病診斷抗原，但由于GRA8基因被正確插入原核表達質粒中，原核重組表達質粒在大腸埃希菌中表達GRA8的水平低，所以本研究利用TMHMM、SignalP4.1和DNAstar等生物學軟件進行了信號肽及疏水區(qū)預測，構建了切除信號肽及疏水區(qū)的截短型sGRA8原核表達載體，通過Western blot驗證表明該重組蛋白具有很好的抗原性，可以做

4、為雞弓形蟲病的診斷抗原。大量表達、純化該重組蛋白后，進行ELISA板包被，經抗原包被量、一二抗、封閉液和底物等相關條件的摸索和優(yōu)化后，確定了sGRA8的最佳工作濃度為1.7μg/ml，陰、陽性血清的最佳稀釋倍數為1∶10，二抗最佳稀釋倍數為1∶6000，sGRA8的最佳包被條件為37℃包被2h后4℃過夜，選用5％脫脂奶粉作為封閉液，最佳封閉時間為1h，抗體的反應時間為1h，酶標抗體最佳作用時間為1h，最佳顯色時間10min。用構建的間接

5、ELISA抗體檢測法與RB公司的雞弓形蟲抗體檢測試劑盒，對人工感染雞弓形蟲7-130d的陽性血清和陰性血清進行平行抗體檢測的結果顯示:7～45d內的符合率為98.26％，RB公司的試劑盒對60d后的血清無法檢出陽性，而構建的間接ELISA對7～130d的陽性血清的檢測敏感度達到80％～100％，且對7種雞球蟲、法氏囊、新城疫和大腸桿菌等雞常見病原體陽性血清的檢測未出現交叉反應。所以本方法是一個敏感性高、特異性強、檢測時間長的雞弓形蟲檢測