PTD-GFP、PTD-EDAG融合蛋白質(zhì)的表達、純化和初步應用.pdf

1、EDAG是一種與造血細胞分化調(diào)控密切相關的核蛋白質(zhì)，對造血系統(tǒng)發(fā)育分化起重要調(diào)控作用，但對其作用機制尚缺乏深入的了解。因此，將EDAG蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導入造血干細胞內(nèi)，研究其對造血干細胞增殖、分化、凋亡調(diào)控的影響，將對闡明其作用機制及應用前景具有重要意義。 為將EDAG蛋白質(zhì)有效導入造血干細胞，我們采用了基于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）的蛋白質(zhì)跨膜遞送技術。它能將與之融合的蛋白質(zhì)以一

2、種濃度依賴的方式跨膜導入細胞，轉(zhuǎn)導效率高，每個細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度近乎相同，且對細胞損傷較小。目前，其在醫(yī)學研究領域中的應用已受到廣泛的關注。 為優(yōu)化跨膜遞送技術各環(huán)節(jié)的條件，我們選擇綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）為研究對象，系統(tǒng)摸索了表達、純化、轉(zhuǎn)導等條件。我們首先采用DNA重組技術構(gòu)建了PTD-GFP表達載體，共構(gòu)建VP22-GFP、Tat-GFP、Tat-GFP-Tat、Tat-GFP-9R4種融合蛋白質(zhì)原核表達載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌

3、BL21，經(jīng)過摸索誘導劑濃度、菌密度、誘導時間等條件，得到各融合蛋白質(zhì)的最佳誘導表達條件。在采用Ni-NTA親和純化柱純化融合蛋白質(zhì)時，我們嘗試了兩種純化途徑：一是天然蛋白質(zhì)直接上柱純化（Native條件）、二是先對表達蛋白質(zhì)變性，然后純化并復性（Hybrid條件）。比較兩種純化路線所得蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)導能力發(fā)現(xiàn)，Hybrid途徑純化的融合蛋白質(zhì)具有較強的跨膜轉(zhuǎn)導能力，其中Tat-GFP-Tat蛋白質(zhì)具有最強的活性。 隨后，我們分

4、別構(gòu)建了VP22-EDAG、Tat-EDAG、Tat-EDAG-Tat和Tat-EDAG-9R的原核表達載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21，經(jīng)誘導均可表達目的蛋白質(zhì)，除由于VP22-EDAG表達量很低，未獲得純化蛋白質(zhì)外，其余得到相應的蛋白質(zhì)，并得到Western-bolt的驗證。 本研究系統(tǒng)摸索了PTD融合蛋白質(zhì)表達、純化、轉(zhuǎn)導等條件，并構(gòu)建了多種PTD-EDAG表達載體，經(jīng)初步純化獲得Tat-EDAG-Tat融合蛋白質(zhì)，為進一步研究