PCR技術(shù)在地表水病原細(xì)菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、為了建立用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)快速檢測(cè)地表水中病原細(xì)菌的方法，本試驗(yàn)旨在研究以Shigelladysenteriae(志賀氏痢疾菌)、Vibriocholerae(霍亂弧菌)、Salmonellatyphrmurium(沙門(mén)氏菌)和Escherichiacoli.(大腸埃希桿菌)作為參考菌株設(shè)計(jì)的通用引物在地表水病原細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。利用16SrRNA基因的高度保守性，設(shè)計(jì)并合成細(xì)菌的通用引物(SP1：5′-AAGGCGACG

2、ATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGA/C-3'，nt1246-1280；SP2：5′-GCTTGCCAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTTGAGC-3′，nt1521-1556)。我們提取了西安市區(qū)幾個(gè)不同水體的水樣和某污水處理廠二級(jí)出水水樣中細(xì)菌的總DNA，使用通用引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行序列測(cè)定及序列同源性分析，同時(shí)檢測(cè)水樣中的細(xì)菌總數(shù)和糞大腸桿菌指標(biāo)。 結(jié)果顯示，通用引物擴(kuò)增4種參考

3、菌株，在電泳圖譜上320bp處均可得到清晰的電泳條帶，其特異性通過(guò)序列測(cè)定及同源性分析得到進(jìn)一步驗(yàn)證；通用引物PCR可檢出250ng/L的大腸桿菌總DNA，其檢測(cè)的靈敏度可達(dá)27.5cfu/100mL；用通用引物對(duì)西安市區(qū)不同地表水樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中一條河流和三個(gè)湖泊以及城市污水處理廠的二級(jí)出水樣品的電泳圖譜上，在320bp處都得到了清晰的電泳條帶，以上的所有水體都被確認(rèn)為受到了生活污水的影響；而另外一條被保護(hù)的很好并可用作飲用水供

4、應(yīng)的水樣中未擴(kuò)增出條帶。我們也使用了傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，并與PCR進(jìn)行比較。與之相對(duì)應(yīng)的糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果顯示，只有污水處理廠二級(jí)出水和一條被污染的湖水水樣有糞大腸桿菌檢出，其它水樣未被檢出，而使用通用引物PCR方法除了可以檢測(cè)到糞大腸桿菌外，還可以檢測(cè)到水樣中其它的一些病原細(xì)菌。 本研究中建立的用PCR方法檢測(cè)水體中病原細(xì)菌與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比較，已經(jīng)顯示出具有特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，它為水環(huán)境中細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供了一種更為