脂肪干細胞在殼聚糖支架材料上構(gòu)建組織工程髓核的實驗研究.pdf

1、椎間盤退變是退行性脊柱疾患的啟動因素，在發(fā)病中起到關(guān)鍵性的作用，椎間盤退變可引起一系列的脊柱退行性變及繼發(fā)性病變，如椎間盤突出癥、脊柱節(jié)段性不穩(wěn)癥和椎管狹窄癥等，這些疾病嚴重威脅廣大人民群眾的身體健康，并在世界范圍內(nèi)帶來了巨大的社會經(jīng)濟影響。對這類疾病的治療方法主要是：早期保守治療、后期手術(shù)治療。在過去30年中，手術(shù)治療主要以減壓及融合的方式為主，目的是解除對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的占位壓迫、重建脊柱穩(wěn)定性。但隨著更長時期的隨訪和病例的不斷積累，

2、融合術(shù)后尤其是多節(jié)段融合術(shù)后相鄰節(jié)段的退變及對功能的損害，越來越被人們所認識，從而成為臨床上具有挑戰(zhàn)性的問題。在20世紀90年代，人工椎間盤技術(shù)開始被引入，以追求非融合的功能重建為目標。在早期病例中，出現(xiàn)了一些令人鼓舞的結(jié)果，但隨之而來的是部分病例術(shù)后原有癥狀并沒有獲得改善，甚至進一步惡化。因此，構(gòu)建組織工程髓核植入物，修復(fù)退變的髓核組織，恢復(fù)椎間盤的結(jié)構(gòu)和功能，保持正常的脊柱節(jié)段運動功能，從根本上來治療退行性脊柱疾患是目前國內(nèi)外研究的

3、重點及熱點。
　　 近年來，脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)引起研究者的關(guān)注，ADSCs與MSCs一樣均屬于來自中胚層的成體干細胞，因此具有較為相似的生物學(xué)特性，但和MSCs相比其來源廣泛，取材簡易。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)兩種干細胞在生長動力學(xué)、細胞老化、基因轉(zhuǎn)染和細胞的粘附特性等方面沒有明顯的差別。ADSCs體外擴增和自我更新能力很強，傳代培養(yǎng)易于獲得大量有分化能力的細胞。對ADSCs進行克隆

4、分析表明，52％的細胞克隆表現(xiàn)出兩個或三個方向的分化潛能。目前已證實ADSCs在一定條件下能夠向中胚層細胞系包括脂肪、軟骨、骨、肌肉和其他胚層細胞系包括神經(jīng)、內(nèi)皮等轉(zhuǎn)化。這些都說明了脂肪組織來源的干細胞具有多向分化的潛能。關(guān)于ADSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化的研究比較多。有研究者用特殊的三維微球培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬軟骨細胞生長環(huán)境，誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細胞分化，可以檢測到aggrecan和Ⅱ/Ⅹ型膠原基因特異表達。髓核細胞具有軟骨細胞表型，其表達

5、軟骨形成的標記基因，包括SOX-9、aggrecan、Ⅱ型膠原基因，這為ADSCs向髓核細胞誘導(dǎo)提供了前提。
　　 椎間盤組織工程研究的另一個重點是尋求能夠作為細胞移植與引導(dǎo)組織生長的天然的或人工合成的支架材料，成為細胞外基質(zhì)的替代物。理想的支架材料應(yīng)該在結(jié)構(gòu)上與椎間盤基質(zhì)成分相似并維持細胞的功能。構(gòu)建符合髓核細胞外基質(zhì)成分并且具有髓核組織生物學(xué)特性的支架材料，是制約椎間盤組織工程的瓶頸。殼聚糖(chitosan)與糖胺聚糖分子

6、結(jié)構(gòu)相似，是惟一帶正電荷的堿性多糖，其結(jié)構(gòu)類似于糖胺聚糖，而糖胺聚糖和Ⅱ型膠原是髓核細胞外基質(zhì)中的主要有形成分。殼聚糖凝膠的陽離子特性，使其容易捕獲軟骨或椎間盤細胞產(chǎn)生的高價陰離子蛋白聚糖，從而有利于椎間盤基質(zhì)功能的維持。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，將殼聚糖支架植入缺損處，一般只會引起很輕微的異物排斥反應(yīng)，在修復(fù)過程中，殼聚糖支架可以加快傷口愈合，這可能是通過刺激免疫細胞分泌生長因子、細胞因子，促進缺損周圍的細胞增殖，從而加速植入支架與正常組織的融合。

7、
　　 目的：證實通過組織工程方法可以減緩與治療椎間盤的退變。
　　 方法：應(yīng)用組織工程技術(shù)，以ADSCs為種子細胞，種植在構(gòu)建的殼聚糖三維支架材料上，并向椎間盤髓核細胞誘導(dǎo)分化，經(jīng)組織化后修復(fù)構(gòu)建的兔椎間盤退變動物模型，最后檢測組織工程髓核的功能。從而評價組織工程髓核的生物學(xué)價值，為組織工程學(xué)治療椎間盤退變性疾病的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　 結(jié)果：1、本課題采用梯度離心法和體外貼壁培養(yǎng)法，可有效分離兔ADSC

8、s，并具有三向分化的潛能，證實本實驗所分離、培養(yǎng)的細胞為ADSCs。2、經(jīng)過冷凍干燥法構(gòu)建的三維殼聚糖支架，具有很高的孔隙率，在水中基本不溶脹，能夠保持細胞支架的形態(tài)，是理想的椎間盤組織工程支架材料。3、新西蘭大白兔髓核抽吸法可以建立腰椎間盤退變的動物模型，方法可靠、重復(fù)性強、手術(shù)簡單并適合常規(guī)應(yīng)用，可為進一步實驗研究提供基礎(chǔ)。4、采用組織工程方法移植到退變椎間盤中的ADSCs殼聚糖支架組織化復(fù)合物可以有效抑制椎間隙狹窄，MRI顯示可減