miR-21調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是一類進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3、-UTR區(qū)域，阻遏靶基因的翻譯，從而抑制基因表達(dá)。miRNAs在許多病理、生理過程中，包括癌癥發(fā)生及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色。miRNAs作為一類新型的調(diào)節(jié)因子，既可以作為原癌基因發(fā)揮作用，也可以作為抑癌基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)特性。miR-21作為一個(gè)典型的原癌基因，在腫瘤的的發(fā)生發(fā)展過程中同樣扮演令人矚目的角色，如肝癌中m

2、iR-21的異常表達(dá)能夠促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。作為 miR-21代表性的靶基因，癌細(xì)胞中 PTEN的失活導(dǎo)致了下游PI3K/AKT和 ERK信號(hào)通路的激活，從而增強(qiáng)了癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力；然而，在PTEN沉默的癌細(xì)胞中，miR-21表達(dá)的變化同樣引起了AKT/ERK信號(hào)通路活性的變化，這表明細(xì)胞中除了PTEN還存在其它機(jī)制調(diào)節(jié)AKT/ERK信號(hào)通路。hSulf-1是一種細(xì)胞膜上的肝素去硫酸酯酶，它能夠?qū)?xì)胞膜上的硫酸肝素蛋白聚糖（

3、HSPG）去硫酸化，從而阻斷肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子信號(hào)的傳導(dǎo)。通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞系中miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-21抑制PTEN表達(dá)的同時(shí)也能夠抑制hSulf-1的表達(dá)。因此，本研究旨在探索miR-21對(duì)hSulf-1及下游信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步研究miR-21對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，為肝癌的臨床基因治療提供新的靶點(diǎn)。
　　第一部分：肝癌細(xì)胞系miR-21的表達(dá)及其與成瘤能力的關(guān)系
　　【目的】檢測(cè)不同細(xì)胞系中miR-

4、21的表達(dá)，確定miR-21與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性。
　　【方法】應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-21在不同轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系及正常細(xì)胞系中的表達(dá)水平；建立肝癌細(xì)胞小鼠體內(nèi)移植瘤模型，兩周后處死，并測(cè)量腫瘤形成情況，比較不同轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞的瘤形成能力，確定miR-21表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性能之間的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】熒光實(shí)時(shí)定量PCR表明，miR-21在肝癌細(xì)胞系MHCC-97H（MHCC-97H:6.73±1.01

5、）中表達(dá)高于MHCC-97L、SMMC-7721（MHCC-97L:4.35±0.53,SMMC-7721:1.10±0.13）中表達(dá)；動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)表明高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC-97H比SMMC-7721細(xì)胞形成更多更大的瘤塊。
　　【結(jié)論】miR-21在高轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞中高表達(dá)，miR-21的高表達(dá)與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。
　　第二部分：miR-21對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖及成瘤能力的影響
　　【目的】研究miR-

6、21對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖及成瘤能力的影響。
　　【方法】采用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-21對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響；應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)研究miR-21對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、成瘤能力的影響。
　　【結(jié)果】劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，miR-21過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲及遷移能力，miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞抑制了細(xì)

7、胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SMMC-7721轉(zhuǎn)染miR-21過表達(dá)載體后促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，MHCC-97H轉(zhuǎn)染miR-21拮抗劑后減弱了細(xì)胞的增殖能力；細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，miR-21過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞增強(qiáng)了細(xì)胞的成瘤能力，MHCC-97H中轉(zhuǎn)染miR-21拮抗劑減弱了MHCC-97H細(xì)胞的腫瘤形成能力。
　　【結(jié)論】miR-21能夠調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖及成瘤能力。
　　第

8、三部分：miR-21調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖的分子機(jī)制
　　【目的】研究miR-21調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖可能的分子機(jī)制。
　　【方法】miR-21過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)處理后SMMC-7721和MHCC-97H中miR-21的表達(dá)；蛋白免疫印跡法檢測(cè)SMMC-7721和MHCC-97H中EMT標(biāo)志物及PTEN、hSulf-1信號(hào)通路

9、的變化。
　　【結(jié)果】熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，SMMC-7721轉(zhuǎn)染miR-21過表達(dá)載體后miR-21表達(dá)上調(diào)，MHCC-97H轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后miR-21表達(dá)下調(diào)；蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-21過表達(dá)導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物β-catenin、vimentin上調(diào)，與此同時(shí)，伴隨著PTEN、hSulf-1的下調(diào)，p-AKT、p-ERK的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。相反的，MHCC-97H細(xì)胞