細胞骨架和鈣蛋白酶在脊髓背根神經節(jié)神經元細胞急性壓力損傷中的作用.pdf

1、急性脊髓損傷是骨科臨床常見病癥,以中青年胸腰段損傷最為常見。由于神經損傷的不可逆性,使脊髓損傷治療困難,致殘率高,給社會及家庭帶來沉重的負擔。據(jù)研究報告顯示,創(chuàng)傷性脊髓損傷在美國每百萬人口中的發(fā)生率為28到55人,而且每年有一萬的新增病例發(fā)生。近年來脊髓損傷的病理機制及修復再生方面取得了一些進展,但原發(fā)性脊髓損傷機制仍不清楚。研究脊髓神經細胞急性損傷的反應機制及超微結構變化,在脊髓損傷的早期進行細胞干預保護,減輕神經細胞進一步病理損害是

2、目前認為最可行的治療方法。
　　目的:通過脊髓背根神經節(jié)神經元細胞的體外培養(yǎng)及機械壓力加載損傷模型,系統(tǒng)觀察細胞骨架及胞膜皮層骨架蛋白在機械壓力損傷及傳導中的變化及作用,探索細胞骨架、鈣蛋白酶及細胞凋亡之間的關系,同時應用新型鈣蛋白酶抑制劑,觀察該抑制劑在神經細胞機械壓力損傷中的保護作用。
　　材料與方法:本課題通過體外培養(yǎng)新生S-D大鼠脊髓背根神經節(jié)神經元細胞,利用專用細胞壓力儀器裝置(國家實用新型專利,專利號ZL2008

3、20030390.7)加載機械壓力損傷,機械壓力損傷值分為空白對照、0.3mpa組、0.5mpa組、0.7mpa組,分別在損傷后培養(yǎng)8小時及24小時觀察檢測分析,排除急性脊髓損傷時的其他干擾致傷因素,采用激光共聚焦顯微鏡、細胞免疫組織化學、原子力顯微鏡、細胞凋亡檢測(TUNEL)等技術,觀察不同損傷條件下細胞骨架及胞膜皮層骨架蛋白的變化情況。探索脊髓損傷的單純壓力因素對神經元細胞的損傷機制,尤其是細胞骨架的變化情況及細胞凋亡的發(fā)生。同時

4、應用新型鈣蛋白酶抑制劑,觀察在機械壓力加載損傷下的細胞保護效應。闡明機械壓力損傷的細胞機械信號傳導的機制及參與結構,進一步認識原發(fā)性脊髓損傷的反應機制,并為急性脊髓損傷的早期干預提供實驗基礎和理論依據(jù)。
　　結果:(1)培養(yǎng)的脊髓背根神經節(jié)神經元原始細胞懸液于四小時后貼壁,初始貼壁的細胞呈形態(tài)均一的小圓形,培養(yǎng)24小時后細胞特征性形態(tài)形成,可見典型長突觸及橢圓形胞體。(2)阿糖胞苷純化可得到純度大于90％的神經元細胞。(3)空白對

5、照組神經元微管蛋白分布均勻連續(xù),沿突觸方向連續(xù)伸展,無斷裂及打結纏繞現(xiàn)象?？捡R斯亮藍細胞骨架染色可見胞內分布均勻,呈網狀交織分布,無骨架的邊集與濃聚現(xiàn)象。(4)倒置顯微鏡觀察見0.5mpa組的細胞有明顯的漂浮生長現(xiàn)象,與培養(yǎng)皿壁脫離,且該組的骨架蛋白損害最明顯,凋亡染色亦最為明顯。(5)原子力顯微鏡觀察得到神經元細胞表面的納米級分辨率的三維成像及顆粒數(shù)據(jù),為精確分析胞膜骨架蛋白的變化提供依據(jù)。(6)機械壓力損傷后細胞與對照組細胞比較,原

6、子力顯微鏡圖像及胞膜表面顆粒數(shù)據(jù)有明顯差異,且隨機械損傷值增加,表面蛋白顆粒高度值增加,粗糙度增高,與未損傷組比較有明顯統(tǒng)計學差異。(7)0.7mpa損傷組胞膜出現(xiàn)多量明顯的離子孔道的開放,表明0.7mpa損傷值可能為神經元細胞所能承受機械打擊的極限。(8)加入終濃度為100μmol/L的鈣蛋白酶抑制劑PD150606預處理后,與損傷未加保護組比較,細胞機械壓力損傷的破壞反應明顯減輕,綜合免疫組化、凋亡染色及原子力顯微鏡觀察,表明鈣蛋白

7、酶抑制劑PD150606在機械壓力損傷脊髓神經方面具有一定的保護作用。
　　結論:(1)本實驗成功建立靜態(tài)機械壓力損傷神經元細胞模型,細胞損傷以細胞骨架及胞膜皮層骨架的反應為主要特征,參與介導了機械信號的生物學轉換。(2)神經元細胞的機械壓力耐受值較低,0.5mpa可以造成明顯細胞損害,0.7mpa直接導致胞膜孔道樣結構出現(xiàn)和細胞的死亡。(3)脊髓損傷早期的蛋白酶抑制劑應用有明顯的神經元細胞保護作用。(4)細胞骨架結構和鈣蛋白酶的