RANKL基因沉默對MG63細胞功能的影響及機制初探.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofNF-κBligand,RANKL)從屬于腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)超家族,是一種表達于成骨細胞、骨髓間質(zhì)細胞和淋巴細胞等細胞表面的膜蛋白,對于T細胞、樹突細胞和破骨細胞的發(fā)育及功能具有重要的作用,其中破骨細胞的分化對于RANKL的表達呈現(xiàn)出絕對的依賴性。研究表明,骨保護素(osteoprotegerin,OPG)/RANKL/核因子

2、κB受體活化因子(receptoractivatorofNF-κB,RANK)信號通路為闡明骨代謝疾病的發(fā)生機制奠定了基礎,OPG和RANK均通過與RANKL競爭性結(jié)合發(fā)揮生物效應,因此RANKL在該骨代謝軸中起樞紐作用。 TNF超家族的絕大多數(shù)成員可抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡,有研究顯示,RANKL抑制單核細胞RAW264.7的增殖,調(diào)節(jié)細胞周期并誘導細胞凋亡,其機制可能與下調(diào)細胞內(nèi)相關基因cyclinD1,cyclinD3,

3、cyclinE,上調(diào)cyclin依賴的激酶抑制劑p27有關。但RANKL對成骨細胞功能的影響及機制研究,國內(nèi)外均未見相關報道。 RNA干擾(RNAinterference,RNAi),又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS),其最大潛能在于它可以在短時間內(nèi)關閉幾乎每一個特定的基因,因此適用于基因功能、藥物靶基因篩選及藥物靶點的驗證,現(xiàn)已廣泛應用于基因功能和基因治療的研究。

4、目前,采用靶向的RNAi技術來研究RANKL基因功能及探索相關的骨代謝疾病的發(fā)病機制和基因治療,國內(nèi)外尚未見研究報道。保留人成骨細胞表型特征的MG63細胞株,近年被廣泛應用于骨代謝疾病的研究。因此,本研究擬利用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術,從RANKL信號分子入手,設計靶向RANKL的短發(fā)夾RNA(smallhairpininterferenceRNA,shRNA),構(gòu)建慢病毒重組表達載體(RNAinter

5、ferenceusingalentivirus-basedsmallhairpinRNA,vshRNA),轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63,建立細胞感染模型;通過測定細胞內(nèi)RANKLmRNA及其蛋白表達水平,評價介導的RNAi對信號分子基因表達的沉默作用;動態(tài)觀察MG63細胞功能的變化(包括細胞增殖、細胞周期、細胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)指標、細胞內(nèi)OPGmRNA的表達),并研究與細胞功能相關基因p53、c

6、yclinD1、survivinmRNA表達的改變,探究RANKL基因?qū)G63細胞功能的影響及相關機制。 研究目標: 總體目標:靶向RANKL基因慢病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建,純化和篩選,并轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63,建立細胞模型;研究該慢病毒載體系統(tǒng)對目的細胞RANKLmRNA含量及蛋白表達的影響;在此基礎上,通過對細胞功能指標及相關基因(p53、cyclinD1、survivinmRNA)表達水平的分析,初步探索RANKL基

7、因沉默對MG63細胞功能的影響及可能機制。包括: 1.RANKL基因RNA干擾慢病毒載體的設計、制備和包裝,獲得靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒重組載體系統(tǒng); 2.重組表達載體轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63,建立細胞模型; 3.通過WesternBlot和RealtimePCR分析,研究vshRNA慢病毒重組載體對MG63細胞RANKL基因表達的抑制作用; 4.通過分析細胞增殖率、細胞周期、細胞堿性磷酸酶

8、(ALP)活力、細胞內(nèi)OPGmRNA的表達,研究RANKL基因?qū)G63細胞功能的影響; 5.通過細胞內(nèi)p53、cyclinD1、survivinmRNA表達改變的研究,探索RANKL基因敲減后MG63細胞功能變化的機制。研究內(nèi)容和方法第1章靶向RANKL基因的shRNA慢病毒重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建目的旨在設計、構(gòu)建目的基因RANKL的RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 針對RANKL靶基因序列,利用Ambion網(wǎng)站按照RNA干擾序

9、列設計原則,設計多個RNA干擾靶點序列,選擇最佳的動力學參數(shù)靶點進入后續(xù)實驗。研究內(nèi)容包括:合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo(具有嚴格的檢測體系,PAGE純化體系),其兩端含酶切位點粘端,直接連入酶切后的RNA干擾載體上;將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞,對長出的克隆先進行PCR鑒定;在進行測序比對后,鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 第2章靶向RANKL基因vshRNA慢病毒重組載體的

10、制備及病毒轉(zhuǎn)染細胞模型的建立合成靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒載體系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63,建立細胞模型。 研究內(nèi)容包括:制備編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞:收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,濃縮后獲得高滴度的慢病毒濃縮液,在293T細胞中測定并標定病毒滴度:獲得的病毒顆粒轉(zhuǎn)染目的細胞MG63,以建立細胞模型。 第3章vshRNA慢病毒重組載體對MG63細胞RANKL基

11、因抑制作用的研究通過Westernblot和RT-PCR研究其對于人成骨樣細胞MG63RANKL蛋白含量和基因表達的影響。 研究內(nèi)容包括:培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞(即MG63細胞),感染當天按實驗設計的分組情況加入不同MOI(multipulyofinfection)的RNAi慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗;感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP/RFP表達情況,5天后采用Westernblot和RT-PCR的方法檢測MG63細胞

12、內(nèi)RNAKL蛋白和mRNA的表達情況,進而判斷不同靶點的干擾效果。Real-timePCR數(shù)值分析采用2-△△Ct分析法;制圖軟件:GraphPadPRISM4.0。 第4章RANKL基因沉默對MG63細胞功能影響的實驗研究利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細胞,通過細胞增殖、細胞周期、細胞ALP活力及OPGmRNA的表達水平,觀察RANKL基因沉默對MG63細胞功能的影響。 4.1細胞生長和增殖根據(jù)實驗需要設置組別,分別為空白

13、對照組(CON)、陰性病毒對照組(NC)和RANKL-vshRNA感染組(KD),每組各3個復孔。分別取4個時間點(是指病毒感染靶細胞后第5天開始接種細胞,檢測的時間點是其后連續(xù)的1、2、3、4天)進行MTT實驗,通過OD值反映細胞的增殖和生長情況。 4.2細胞周期根據(jù)實驗需要設置組別,分別為CON組、NC組和KD組,每組各3個復孔。利用pGCL-GFEretro-3病毒感染MG63細胞,5天后開始接種細胞,利用細胞內(nèi)DNA能夠

14、和PI熒光染料結(jié)合的特性,細胞各個時期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同,通過流式細胞術檢測細胞凋亡,并通過熒光度確定各個時期細胞所占比例。 4.3細胞堿性磷酸酶(ALP)活力根據(jù)實驗需要設置組別,分別為CON、NC和KD,每組各3個復孔。分別取4個時間點(是指病毒感染靶細胞后第5天開始接種細胞,檢測的時間點是其后連續(xù)的1、2、3、4天),進行ALP活力的測定。 4.4細胞OPGmRNA含量根據(jù)實驗需要設置組別,

15、分別為CON組、NC組和KD組,每組各3個復孔。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞,感染當天按實驗設計的組別加入RNAi慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗。感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況,感染5天后收集細胞。采用RT-PCR的方法檢測OPGmRNA表達情況。 4.5結(jié)果統(tǒng)計采用軟件SPSS12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量指標結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用MicrosoftExcel進行作圖處理。Real-timePCR數(shù)

16、值分析采用2-△△Ct分析法,制圖軟件為GraphPadPRISM4.0。 第5章RANKL基因沉默對NG63細胞功能影響的機制初探在以上研究的基礎上,利用該病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細胞,觀察細胞內(nèi)與細胞功能相關基因p53、survivin及cyclinD1mRNA的表達水平。 Real-timePCR檢測p53、survivin及cyclinD1基因mRNA的表達根據(jù)實驗需要設置組別,分別為CON組、NC組和KD組,每組各

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