RANKL基因沉默對MG63細胞功能的影響及機制初探.pdf

1、核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofNF-κBligand，RANKL)從屬于腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)超家族，是一種表達于成骨細胞、骨髓間質(zhì)細胞和淋巴細胞等細胞表面的膜蛋白，對于T細胞、樹突細胞和破骨細胞的發(fā)育及功能具有重要的作用，其中破骨細胞的分化對于RANKL的表達呈現(xiàn)出絕對的依賴性。研究表明，骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/RANKL/核因子

2、κB受體活化因子(receptoractivatorofNF-κB，RANK)信號通路為闡明骨代謝疾病的發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)，OPG和RANK均通過與RANKL競爭性結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)，因此RANKL在該骨代謝軸中起樞紐作用。 TNF超家族的絕大多數(shù)成員可抑制細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，有研究顯示，RANKL抑制單核細胞RAW264.7的增殖，調(diào)節(jié)細胞周期并誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)細胞內(nèi)相關(guān)基因cyclinD1，cyclinD3，

3、cyclinE，上調(diào)cyclin依賴的激酶抑制劑p27有關(guān)。但RANKL對成骨細胞功能的影響及機制研究，國內(nèi)外均未見相關(guān)報道。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)，其最大潛能在于它可以在短時間內(nèi)關(guān)閉幾乎每一個特定的基因，因此適用于基因功能、藥物靶基因篩選及藥物靶點的驗證，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療的研究。

4、目前，采用靶向的RNAi技術(shù)來研究RANKL基因功能及探索相關(guān)的骨代謝疾病的發(fā)病機制和基因治療，國內(nèi)外尚未見研究報道。保留人成骨細胞表型特征的MG63細胞株，近年被廣泛應(yīng)用于骨代謝疾病的研究。因此，本研究擬利用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，從RANKL信號分子入手，設(shè)計靶向RANKL的短發(fā)夾RNA(smallhairpininterferenceRNA，shRNA)，構(gòu)建慢病毒重組表達載體(RNAinter

5、ferenceusingalentivirus-basedsmallhairpinRNA，vshRNA)，轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63，建立細胞感染模型；通過測定細胞內(nèi)RANKLmRNA及其蛋白表達水平，評價介導(dǎo)的RNAi對信號分子基因表達的沉默作用；動態(tài)觀察MG63細胞功能的變化(包括細胞增殖、細胞周期、細胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)指標(biāo)、細胞內(nèi)OPGmRNA的表達)，并研究與細胞功能相關(guān)基因p53、c

6、yclinD1、survivinmRNA表達的改變，探究RANKL基因?qū)G63細胞功能的影響及相關(guān)機制。 研究目標(biāo): 總體目標(biāo)：靶向RANKL基因慢病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建，純化和篩選，并轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63，建立細胞模型；研究該慢病毒載體系統(tǒng)對目的細胞RANKLmRNA含量及蛋白表達的影響；在此基礎(chǔ)上，通過對細胞功能指標(biāo)及相關(guān)基因(p53、cyclinD1、survivinmRNA)表達水平的分析，初步探索RANKL基

7、因沉默對MG63細胞功能的影響及可能機制。包括： 1.RANKL基因RNA干擾慢病毒載體的設(shè)計、制備和包裝，獲得靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒重組載體系統(tǒng)； 2.重組表達載體轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63，建立細胞模型； 3.通過WesternBlot和RealtimePCR分析，研究vshRNA慢病毒重組載體對MG63細胞RANKL基因表達的抑制作用； 4.通過分析細胞增殖率、細胞周期、細胞堿性磷酸酶

8、(ALP)活力、細胞內(nèi)OPGmRNA的表達，研究RANKL基因?qū)G63細胞功能的影響； 5.通過細胞內(nèi)p53、cyclinD1、survivinmRNA表達改變的研究，探索RANKL基因敲減后MG63細胞功能變化的機制。研究內(nèi)容和方法第1章靶向RANKL基因的shRNA慢病毒重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建目的旨在設(shè)計、構(gòu)建目的基因RANKL的RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 針對RANKL靶基因序列，利用Ambion網(wǎng)站按照RNA干擾序

9、列設(shè)計原則，設(shè)計多個RNA干擾靶點序列，選擇最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點進入后續(xù)實驗。研究內(nèi)容包括：合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo(具有嚴(yán)格的檢測體系，PAGE純化體系)，其兩端含酶切位點粘端，直接連入酶切后的RNA干擾載體上；將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆先進行PCR鑒定；在進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 第2章靶向RANKL基因vshRNA慢病毒重組載體的

10、制備及病毒轉(zhuǎn)染細胞模型的建立合成靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒載體系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞MG63，建立細胞模型。 研究內(nèi)容包括：制備編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞：收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，濃縮后獲得高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細胞中測定并標(biāo)定病毒滴度：獲得的病毒顆粒轉(zhuǎn)染目的細胞MG63，以建立細胞模型。 第3章vshRNA慢病毒重組載體對MG63細胞RANKL基

11、因抑制作用的研究通過Westernblot和RT-PCR研究其對于人成骨樣細胞MG63RANKL蛋白含量和基因表達的影響。 研究內(nèi)容包括：培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞(即MG63細胞)，感染當(dāng)天按實驗設(shè)計的分組情況加入不同MOI(multipulyofinfection)的RNAi慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗；感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP/RFP表達情況，5天后采用Westernblot和RT-PCR的方法檢測MG63細胞

12、內(nèi)RNAKL蛋白和mRNA的表達情況，進而判斷不同靶點的干擾效果。Real-timePCR數(shù)值分析采用2-△△Ct分析法；制圖軟件：GraphPadPRISM4.0。 第4章RANKL基因沉默對MG63細胞功能影響的實驗研究利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細胞，通過細胞增殖、細胞周期、細胞ALP活力及OPGmRNA的表達水平，觀察RANKL基因沉默對MG63細胞功能的影響。 4.1細胞生長和增殖根據(jù)實驗需要設(shè)置組別，分別為空白

13、對照組(CON)、陰性病毒對照組(NC)和RANKL-vshRNA感染組(KD)，每組各3個復(fù)孔。分別取4個時間點(是指病毒感染靶細胞后第5天開始接種細胞，檢測的時間點是其后連續(xù)的1、2、3、4天)進行MTT實驗，通過OD值反映細胞的增殖和生長情況。 4.2細胞周期根據(jù)實驗需要設(shè)置組別，分別為CON組、NC組和KD組，每組各3個復(fù)孔。利用pGCL-GFEretro-3病毒感染MG63細胞，5天后開始接種細胞，利用細胞內(nèi)DNA能夠

14、和PI熒光染料結(jié)合的特性，細胞各個時期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，并通過熒光度確定各個時期細胞所占比例。 4.3細胞堿性磷酸酶(ALP)活力根據(jù)實驗需要設(shè)置組別，分別為CON、NC和KD，每組各3個復(fù)孔。分別取4個時間點(是指病毒感染靶細胞后第5天開始接種細胞，檢測的時間點是其后連續(xù)的1、2、3、4天)，進行ALP活力的測定。 4.4細胞OPGmRNA含量根據(jù)實驗需要設(shè)置組別，

15、分別為CON組、NC組和KD組，每組各3個復(fù)孔。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞，感染當(dāng)天按實驗設(shè)計的組別加入RNAi慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗。感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，感染5天后收集細胞。采用RT-PCR的方法檢測OPGmRNA表達情況。 4.5結(jié)果統(tǒng)計采用軟件SPSS12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量指標(biāo)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用MicrosoftExcel進行作圖處理。Real-timePCR數(shù)

16、值分析采用2-△△Ct分析法，制圖軟件為GraphPadPRISM4.0。 第5章RANKL基因沉默對NG63細胞功能影響的機制初探在以上研究的基礎(chǔ)上，利用該病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細胞，觀察細胞內(nèi)與細胞功能相關(guān)基因p53、survivin及cyclinD1mRNA的表達水平。 Real-timePCR檢測p53、survivin及cyclinD1基因mRNA的表達根據(jù)實驗需要設(shè)置組別，分別為CON組、NC組和KD組，每組各