幽門螺桿菌sabA基因的克隆表達及江西地區(qū)幽門螺桿菌外膜蛋白的序列特征.pdf

1、研究背景與目的：
　　 外膜蛋白與H.pylori的定植、胃黏膜的損傷、炎性介質(zhì)的分泌和中性粒細胞的浸潤等有著密切關(guān)系，同時它是激發(fā)免疫反應的主要成份，可誘導強大的菌株特異性免疫反應，這在H.pylori的致病中起重要作用。H.pylori感染后的轉(zhuǎn)歸主要受細菌因素、宿主因素和環(huán)境因素三者的影響，其中細菌因素在H.pylori感染結(jié)局的多樣性中起重要作用，H.pylori毒力因子的基因多態(tài)性也是重要原因。以往對H.pylori毒

2、力的研究多集中在尿素酶、細胞毒素相關(guān)蛋白(Cag)、空泡毒素(VacA)等方面上，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)H.pylori外膜蛋白與其定植、炎性介質(zhì)的分泌、胃黏膜的損傷和中性粒細胞的浸潤等有著密切關(guān)系。為了研究H.pylori疫苗的候選抗原成分和更好的防治H.pylori感染，本文將構(gòu)建H.pylori外膜蛋白唾液酸結(jié)合黏附素(SabA)的重組質(zhì)粒并檢測其體外表達重組蛋白的抗原性和分析來自江西臨床H.pylori菌株的前炎性外膜蛋白A(out

3、erinflammatory proteinA，OipA)、血型抗原結(jié)合黏附素(blood-group antigenbindingadhesion，BabA)、唾液酸結(jié)合黏附素(sialic acid-binding adhesion，SabA)的基因序列特征，并與來自東亞和非東亞地區(qū)的22株H.pylori的序列進行比對，分析不同區(qū)域的序列特征。探明我國外膜蛋白的基因特征對于研究其與疾病的關(guān)系具有重要意義以及為SabA作為靶抗原的研

4、究奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.幽門螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素的克隆表達：
　　 (1)以H.pylori26695株基因組為模板，設(shè)計sabA基因特異性引物擴增目的基因；
　　 (2)將PCR產(chǎn)物插入到pGEX-4T-1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21中誘導表達；
　　 (3)表達蛋白經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定，并用免疫印跡法評價其抗原性。
　　 2.幽門螺桿菌外膜蛋白(OipA、BabA、

5、SabA)的基因序列特征分析：
　　 (1)對前期分離的154株臨床H.pylori菌株進行復蘇培養(yǎng)，并提取其基因組DNA；
　　 (2)針對Hpylori外膜蛋白(OipA、BabA、SabA)設(shè)計多對特異性全長測序引物；
　　 (3)進行目的基因的擴增，并將其產(chǎn)物送于公司測序；
　　 (4)利用生物信息學軟件MEGA、AlignX、ClustalX2和相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫進行DNA序列、氨基酸序列比對，分析

6、江西地區(qū)的序列特征。
　　 (5)將江西臨床菌株序列與來自不同區(qū)域的22株H.pylori菌株序列進行比對，分析不同區(qū)域的序列特征，找出江西地區(qū)菌株序列的特異性。
　　 結(jié)果：
　　 1.幽門螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素的克隆表達結(jié)果：
　　 (1)獲得H.pylori26695的唾液酸黏附素基因，并經(jīng)酶切鑒定基因sabA成功插入到pGEX-4T-1載體中。
　　 (2)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-sa

7、bA在大腸桿菌BL21中表達，經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定為幽門螺桿菌外膜蛋白SabA，且該蛋白具有抗原性。
　　 2.幽門螺桿菌外膜蛋白(OipA、BabA、SabA)的基因序列特征分析結(jié)果：
　　 (1)擴增出臨床菌株外膜蛋白的OipA、BabA、SabA三個基因，且多對引物PCR的三個基因陽性率均為100％。根據(jù)DNA序列翻譯成氨基酸的方法，預測外膜蛋白OipA的蛋白質(zhì)表達陽性率為99.33％，BabA和SabA的蛋白質(zhì)表達陽性

8、率分別為75.89％和61.90％。babA基因序列有52.43％的堿基位點發(fā)生突變明顯高于sabA基因序列的49.28％，而翻譯成的氨基酸序列后，babA氨基酸序列有42.38％的氨基酸位點發(fā)生突變明顯低于sabA氨基酸序列的46.96％，說明babA的堿基位點突變多數(shù)為同義突變，DNA序列的變化不影響氨基酸的變化。
　　 (2)DNA序列比對聚類分析結(jié)果：
　　 ①oipA基因中有257個堿基點發(fā)生了突變，占基因全長

9、的27.81％，與不同地區(qū)的菌株序列比對發(fā)現(xiàn)江西地區(qū)的菌株序列CT重復數(shù)不明顯。將序列聚類可分為七大類，其中來自非東亞地區(qū)的菌株序列聚為一個小類，而來自東亞地區(qū)的菌株序列卻分別與江西菌株序列聚為不同的小類。
　　 ②babA基因中有1209個位點堿基發(fā)生突變，占基因全長的52.43％，比對發(fā)現(xiàn)babA整個基因基因序列在600～1100位點存在一個高突變區(qū)域。將序列聚類大致可以分為兩類，其中來自非東亞地區(qū)的菌株序列聚為一個類別，而

10、來自韓國的菌株序列卻聚為一個小類，來自日本的菌株序列分別與江西菌株序列聚為不同的小類。
　　 ③sabA基因中有1021個堿基位點發(fā)生了突變，占全長基因的49.28％，比對發(fā)現(xiàn)sabA整個基因序列在0～100、200～1200位點存在兩個高突變區(qū)，與不同地區(qū)的菌株序列比對發(fā)現(xiàn)江西臨床菌株序列不存在CT重復序列。將其聚類可以分為兩個大類，來自東亞地區(qū)的菌株序列與江西菌株序列聚為不同的小類。
　　 (3)氨基酸序列比對聚類分

11、析結(jié)果：
　　 ①oipA氨基酸序列中有81個位點氨基酸發(fā)生了突變，占全長氨基酸序列的26.30％，其等電點在9.42～10.03之間，平均值為9.62；不穩(wěn)定指數(shù)在16.12～23.81之間，平均值為18.91；脂肪指數(shù)在77.30～82.11，平均值為79.73；親水值在-0.385～-0.255之間，平均值為-0.341。將所有推測出的氨基酸序列進行比對聚類分析，此聚類圖顯示根據(jù)氨基酸的變化將氨基酸序列大致分為七類，和DN

12、A序列聚類是對應的。
　　 ②babA的氨基酸序列中有317個位點氨基酸發(fā)生了突變，占全長氨基酸序列的42.38％，其等電點在6.15～11.00之間，平均值為9.18；不穩(wěn)定指數(shù)在-1.86～43.61之間，平均值為21.59；脂肪指數(shù)在0～92.08，平均值為67.21；親水值在-1.575～0.020之間，平均值為-0.426。將所有推測出的氨基酸序列進行比對聚類分析，大致可以分為三個大類，其中142號菌株的氨基酸序列和其

13、他菌株的氨基酸序列有著很大的差異性。
　　 ③sabA的氨基酸序列中有1021個位點氨基酸發(fā)生了突變，占全長氨基酸序列的46.96％，其等電點在4.93～12.31之間，平均值為9.29，不穩(wěn)定指數(shù)在7.66～62.90之間，平均值為31.37；脂肪指數(shù)在71.78～149.41，平均值為90.60；親水值在-0.761～1.200之間，平均值為-0.181。將所有推測出的氨基酸序列進行比對聚類分析，大致可以分類兩個大類。