尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素基因的克隆、表達(dá)與轉(zhuǎn)植的初步研究.pdf

1、尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）隸屬于鱸形目（Percifomes）、麗魚(yú)科(Cichlidae)，為聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向世界各國(guó)推薦的養(yǎng)殖對(duì)象，現(xiàn)已成為中國(guó)重要的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)品種。但近年來(lái)養(yǎng)殖羅非魚(yú)暴發(fā)了鏈球菌病，導(dǎo)致羅非魚(yú)的大量死亡，威脅著我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，因此很有必要開(kāi)展羅非魚(yú)免疫防御機(jī)制的研究。γ-干擾素是調(diào)控天然免疫和細(xì)胞免疫的一種重要的細(xì)胞因子，除了具有抗病毒作用外，干擾素還參與到其他重要的生理反應(yīng)

2、中，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡及免疫反應(yīng)等，近年的研究發(fā)現(xiàn)干擾素中的γ-干擾素還具有顯著的抗菌作用。本研究克隆了尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素基因，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了其在無(wú)乳鏈球菌感染前后各組織和器官中的表達(dá)，以了解γ-干擾素基因在尼羅羅非魚(yú)免疫防御過(guò)程中的作用；同時(shí)以斑馬魚(yú)作為轉(zhuǎn)基因研究模型，評(píng)估金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因魚(yú)研制上應(yīng)用的可行性，并應(yīng)用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因羅非魚(yú)。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素基因的克隆與表

3、達(dá)特性分析。本研究從尼羅羅非魚(yú)脾臟組織中擴(kuò)增到γ-干擾素基因的cDNA，其大小為690bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?21bp，推測(cè)編碼206個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素分子包含1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)核定位信號(hào)。其二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有10個(gè)α-螺旋、13個(gè)β-折疊，具有較強(qiáng)的親水性。同源性分析顯示，其與斜帶石斑魚(yú)γ-干擾素相似性最高（61.5％）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常尼羅羅非魚(yú)個(gè)體γ-干擾素基因在不同組織中的表達(dá)，結(jié)果表明該基因

4、在脾臟中表達(dá)量最高，其次是腸、鰓和腎臟，在心臟、肌肉和皮膚組織中的表達(dá)量則較低。感染無(wú)乳鏈球菌后，尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素基因在脾臟、皮膚、腎和鰓中的表達(dá)均顯著上調(diào)。推測(cè)尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素參與魚(yú)體對(duì)病原菌的防御過(guò)程，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。同時(shí)應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)制備尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素重組融合蛋白，為進(jìn)一步了解其功能奠定基礎(chǔ)。
　　2. Tgf2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在轉(zhuǎn)RFP基因斑馬魚(yú)上的應(yīng)用。本研究利用近年開(kāi)發(fā)的金魚(yú)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)

5、的研制，探討其在轉(zhuǎn)基因魚(yú)上應(yīng)用的可行性。通過(guò) PCR手段，改造轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-EF1α-eGFP，將肌球蛋白輕鏈2啟動(dòng)子(mylz2)與紅色熒光蛋白基因(RFP)定向插入其中，構(gòu)建紅色熒光蛋白基因肌肉組織特異性表達(dá)供體質(zhì)粒pTgf2-Mylz2-RFP。通過(guò)顯微注射，將轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射于斑馬魚(yú)受精卵中，共注射受精卵972粒，仔魚(yú)出膜803尾，其中攜帶外源基因的仔魚(yú)615尾，陽(yáng)性率為76.6%。轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白

6、基因斑馬魚(yú)的F0代培育至性成熟，將10尾F0代斑馬魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)配對(duì)繁殖，其中1個(gè)組合產(chǎn)生了體表呈現(xiàn)均勻紅色熒光的F1個(gè)體，RFP在F0代的整合率為10%。將紅色熒光F1個(gè)體培育至性成熟并與野生型魚(yú)配對(duì)繁殖，F(xiàn)2代的陽(yáng)性個(gè)體占69%。本研究結(jié)果說(shuō)明由Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù),可有效提高目的基因的轉(zhuǎn)植效率與整合效率，在轉(zhuǎn)基因魚(yú)構(gòu)建以及相關(guān)研究中具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
　　3.尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素基因轉(zhuǎn)基因元件的構(gòu)建及在斑馬魚(yú)中的

7、轉(zhuǎn)植。定向改造金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-hsp70-eGFP，用尼羅羅非魚(yú)γ-干擾素基因替換GFP基因，構(gòu)建由hsp70啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的γ-干擾素基因Tgf2轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-hsp70-γIFN。通過(guò)顯微注射，將轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射于斑馬魚(yú)受精卵中，共注射受精卵3000粒，仔魚(yú)出膜1480粒。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)F0代培育至性成熟后，與野生型魚(yú)配對(duì)繁殖，首批8尾轉(zhuǎn)基因魚(yú)中有2尾獲得F1陽(yáng)性個(gè)體，可遺傳率為25%