尼羅羅非魚γ-干擾素基因的克隆、表達與轉(zhuǎn)植的初步研究.pdf

1、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）隸屬于鱸形目（Percifomes）、麗魚科(Cichlidae)，為聯(lián)合國糧農(nóng)組織向世界各國推薦的養(yǎng)殖對象，現(xiàn)已成為中國重要的養(yǎng)殖魚類品種。但近年來養(yǎng)殖羅非魚暴發(fā)了鏈球菌病，導(dǎo)致羅非魚的大量死亡，威脅著我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，因此很有必要開展羅非魚免疫防御機制的研究。γ-干擾素是調(diào)控天然免疫和細胞免疫的一種重要的細胞因子，除了具有抗病毒作用外，干擾素還參與到其他重要的生理反應(yīng)

2、中，如調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡及免疫反應(yīng)等，近年的研究發(fā)現(xiàn)干擾素中的γ-干擾素還具有顯著的抗菌作用。本研究克隆了尼羅羅非魚γ-干擾素基因，實時定量PCR檢測了其在無乳鏈球菌感染前后各組織和器官中的表達，以了解γ-干擾素基因在尼羅羅非魚免疫防御過程中的作用；同時以斑馬魚作為轉(zhuǎn)基因研究模型，評估金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因魚研制上應(yīng)用的可行性，并應(yīng)用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因羅非魚。主要研究內(nèi)容如下：
　　1.尼羅羅非魚γ-干擾素基因的克隆與表

3、達特性分析。本研究從尼羅羅非魚脾臟組織中擴增到γ-干擾素基因的cDNA，其大小為690bp，開放閱讀框為621bp，推測編碼206個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，尼羅羅非魚γ-干擾素分子包含1個信號肽和1個核定位信號。其二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有10個α-螺旋、13個β-折疊，具有較強的親水性。同源性分析顯示，其與斜帶石斑魚γ-干擾素相似性最高（61.5％）。實時熒光定量PCR檢測正常尼羅羅非魚個體γ-干擾素基因在不同組織中的表達，結(jié)果表明該基因

4、在脾臟中表達量最高，其次是腸、鰓和腎臟，在心臟、肌肉和皮膚組織中的表達量則較低。感染無乳鏈球菌后，尼羅羅非魚γ-干擾素基因在脾臟、皮膚、腎和鰓中的表達均顯著上調(diào)。推測尼羅羅非魚γ-干擾素參與魚體對病原菌的防御過程，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。同時應(yīng)用原核表達系統(tǒng)制備尼羅羅非魚γ-干擾素重組融合蛋白，為進一步了解其功能奠定基礎(chǔ)。
　　2. Tgf2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在轉(zhuǎn)RFP基因斑馬魚上的應(yīng)用。本研究利用近年開發(fā)的金魚轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)基因斑馬魚

5、的研制，探討其在轉(zhuǎn)基因魚上應(yīng)用的可行性。通過 PCR手段，改造轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-EF1α-eGFP，將肌球蛋白輕鏈2啟動子(mylz2)與紅色熒光蛋白基因(RFP)定向插入其中，構(gòu)建紅色熒光蛋白基因肌肉組織特異性表達供體質(zhì)粒pTgf2-Mylz2-RFP。通過顯微注射，將轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射于斑馬魚受精卵中，共注射受精卵972粒，仔魚出膜803尾，其中攜帶外源基因的仔魚615尾，陽性率為76.6%。轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白

6、基因斑馬魚的F0代培育至性成熟，將10尾F0代斑馬魚與野生型斑馬魚配對繁殖，其中1個組合產(chǎn)生了體表呈現(xiàn)均勻紅色熒光的F1個體，RFP在F0代的整合率為10%。將紅色熒光F1個體培育至性成熟并與野生型魚配對繁殖，F(xiàn)2代的陽性個體占69%。本研究結(jié)果說明由Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù),可有效提高目的基因的轉(zhuǎn)植效率與整合效率，在轉(zhuǎn)基因魚構(gòu)建以及相關(guān)研究中具有開發(fā)應(yīng)用前景。
　　3.尼羅羅非魚γ-干擾素基因轉(zhuǎn)基因元件的構(gòu)建及在斑馬魚中的

7、轉(zhuǎn)植。定向改造金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-hsp70-eGFP，用尼羅羅非魚γ-干擾素基因替換GFP基因，構(gòu)建由hsp70啟動子驅(qū)動的γ-干擾素基因Tgf2轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-hsp70-γIFN。通過顯微注射，將轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射于斑馬魚受精卵中，共注射受精卵3000粒，仔魚出膜1480粒。轉(zhuǎn)基因斑馬魚F0代培育至性成熟后，與野生型魚配對繁殖，首批8尾轉(zhuǎn)基因魚中有2尾獲得F1陽性個體，可遺傳率為25%