絲素蛋白基大孔微載體共培養(yǎng)C3A細胞治療大鼠急性肝衰竭的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝臟是人體最重要的臟器之一，擔負著人體分泌膽汁、凝血、新陳代謝、吞噬或免疫作用、解毒、調(diào)節(jié)水與電解質(zhì)等一系列復雜的生理功能。急性肝功能衰竭是以快速進展的嚴重肝功能損害引起嚴重肝功能不全疾病，嚴重危及人類生命。各種原因引起的急性肝功能衰竭，常規(guī)治療病死率高達60-80％。目前臨床上急性肝功能衰竭的有效治療手段主要包括三種:原位肝移植、生物人工肝支持系統(tǒng)以及肝細胞移植。隨著肝臟移植技術的發(fā)展及免疫抑制劑的使用，目前

2、肝臟移植已經(jīng)被認為是治療各種終末期肝病及急性肝衰竭唯一有效的治療手段。但因為肝器官移植受到供體器官短缺、手術風險大、治療費用高、術后免疫排斥導致供肝功能喪失以及終生需要服用免疫抑制劑治療等因素的限制，決定了其在我國廣泛應用仍有一定的困難。以體外培養(yǎng)的肝細胞為核心構建的生物型人工肝支持系統(tǒng)是一種理想的替代治療方法，但是因生物反應器價格昂貴、供肝細胞來源以及其治療過程中可能產(chǎn)生的血流動力學紊亂等因素制約了其臨床廣泛應用。肝細胞移植具有技術簡

3、單，容易操作，對患者創(chuàng)傷小、費用相對低廉、肝細胞在體外培養(yǎng)后減少了細胞表面的抗原性，可以降低免疫排斥反應、移植肝細胞可以發(fā)揮肝臟解毒、合成功能等特殊優(yōu)勢。相關試驗研究已證明肝細胞移植可延長急性肝衰竭患者供體等待時間，明顯改善患者的肝功能水平，由于肝臟的再生能力和潛力很大，在接受肝細胞移植后，部分患者殘存的肝臟得以再生，肝功能可以恢復至正常水平。因此，肝細胞移植已被認為是對終末期肝疾病及急性肝衰竭的一種具有良好發(fā)展前景的治療方法。但是，它

4、需要解決的問題仍有很多，主要包括細胞來源問題和高密度高活性肝細胞培養(yǎng)問題。肝細胞的質(zhì)與量是肝細胞移植研究中的關鍵問題，如何方便地獲取高密度、高質(zhì)量、高活性的肝細胞已成為肝細胞移植成功需要解決的重要問題。以生物支架材料大孔微載體為核心的三維肝細胞培養(yǎng)有望解決此難題。主要利用微載體懸浮培養(yǎng)技術來實現(xiàn)肝細胞的高密度培養(yǎng)及擴增，使細胞在數(shù)量上及功能上都能達到臨床應用的要求。利用微載體懸浮培養(yǎng)技術進行種子細胞的擴增和用來充當體內(nèi)細胞治療的傳輸載體

5、，近年來在肝細胞移植、生物人工肝及組織工程領域的應用研究正日趨升溫。相比于實心微載體，大孔微載體的明顯優(yōu)勢在于為細胞生長、粘附、增殖提供了足夠的空間和更大的面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的進入和代謝產(chǎn)物的排出，從而提高了細胞代謝活性和培養(yǎng)密度。然而，目前市售的微載體的主要成分多見于明膠、葡聚糖、纖維素等，缺乏肝細胞特異性，細胞生長較為緩慢，不容易黏附于微載體表面;而且隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞容易脫落、死亡，從而降低了細胞培養(yǎng)密度和活性。隨著對組織

6、工程支架材料的深入研究，研究人員發(fā)現(xiàn)對高分子材料進行適當?shù)幕瘜W改性、表面修飾等處理，以增強其力學特性，生物相容性及肝特異性，可誘導和提高肝細胞在支架上的黏附和增殖行為。在肝組織工程支架方面，半乳糖基是肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的特異性配體，是肝細胞識別的相應位點并能產(chǎn)生特異性相互作用。以半乳糖基修飾各種天然原材料的和人工聚合物，通過聚合物鏈上的半乳糖基和肝細胞表面去

7、唾液酸糖蛋白受體之間獨特的分子識別功能，優(yōu)化支架的肝細胞特異性，提高肝細胞的特異功能。在肝組織工程細胞外基質(zhì)支架材料上接枝半乳糖基，可誘導和提高肝細胞在細胞外基質(zhì)支架上的粘附和增殖行為。我們的前期研究工作中，以生物相容性良好的天然高分子材料絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸為原料，把半乳糖基引入殼聚糖中，應用乳化-化學交聯(lián)將絲素蛋白與半乳糖基化殼聚糖復合，經(jīng)過極性溶液處理、冷凍干燥等處理，制備出了一種肝細胞特異性絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載

8、體。成功建立了絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體制備技術，掃描電子顯微鏡觀察該大孔微載體表面及內(nèi)部呈多孔結構，開口向外，呈喇叭狀，孔的分布均勻，適合于肝細胞高密度培養(yǎng)。并通過1HNMR譜、FITR譜表征，證實半乳糖基已經(jīng)成功接枝到支架材料之中。該支架材料中引入了肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的特異性配體—半乳糖基，成功制備出了一種具有肝細胞特異性的高性能的大孔微載體。體外絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體與肝細胞系C3A細胞

9、懸浮培養(yǎng)實驗表明肝細胞能與大孔微載體特異性黏附、細胞圍繞微載體聚集生長，并表現(xiàn)出很好的活力。然而，體內(nèi)環(huán)境相對于體外環(huán)境更為復雜， SF/GC大孔微載體C3A細胞復合物在體內(nèi)能否有效存活？能否對動物急性肝衰竭模型進行有效的提高生存率、改善肝功能、減輕肝臟損傷？這些問題的深入探討無疑將有助于細胞移植技術的發(fā)展?；谘芯楷F(xiàn)狀以及本課題組前期的工作結果，本實驗擬采用絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體C3A細胞懸浮培養(yǎng)形成的復合物腹腔內(nèi)移植的方

10、法，以觀察SF/GC大孔微載體C3A細胞復合物對急性肝功能衰竭的治療效果。本研究旨在探討SF/GC大孔微載體C3A細胞復合物在動物急性肝衰模型體內(nèi)移植的可行性，為今后臨床上更好的應用細胞移植技術治療急性肝衰竭提供必要的理論和實驗依據(jù)。
　　 目的：
　　 以肝細胞系C3A細胞為移植細胞，以絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體為載體，對C3A細胞行大孔微載體粘附培養(yǎng)、檢測其生物學特性，探討將絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微

11、載體粘附培養(yǎng)C3A細胞復合物植入到切除80％肝組織的急性肝功能衰竭大鼠模型腹腔內(nèi)，觀察存活率，檢測肝功能水平及觀察肝臟組織學變化，評價其對急性肝衰大鼠的治療效果，為將來臨床應用提供必要的理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 首先采用冷凍干燥法制備絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體，與肝細胞系C3A細胞進行粘附共培養(yǎng)，對其生物相容性及細胞功能進行檢測，確定行大孔微載體C3A復合體移植的最佳時期。然后切除大鼠80％肝臟組織構

12、建SD大鼠急性肝功能衰竭模型。最后大鼠肝衰模型建立后分別將培養(yǎng)72h的絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體C3A細胞復合物（A組）、C3A細胞懸液2mL(含6.0×107個C3A細胞，B組)植入到急性肝功能衰竭大鼠腹腔內(nèi)。觀察移植后大鼠1周內(nèi)存活率，檢測血清白蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)肝功能指標，檢查肝臟組織學變化。
　　 結果：
　　 大孔微載體C3A細胞共培養(yǎng)第3天上清液中葡萄糖消耗及

13、白蛋白濃度最高。絲素蛋白/半乳糖基殼聚糖大孔微載體C3A細胞復合物對急性肝衰竭模型動物的實驗顯示，移植后1周急性肝衰竭大鼠的存活率分析比較:微載體組動物的生存率明顯高于其他兩組，A組為50％，B組為40％，C組為10％，各移植組高于對照組(P＜0.05)。移植后1周內(nèi)，微載體組肝功能各項指標水平逐漸下降，移植術后第7天肝功能各項指標逐漸接近正常水平，與移植第1日有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。對照組肝功能各項指標水平無明顯下降趨勢，A

14、LT水平于移植術后第1日達最高峰。肝組織切片形態(tài)學觀察示大孔微載體C3A細胞復合物組移植第7天后肝臟病理有不同程度的恢復，較其他兩組有明顯改善。
　　 結論：
　　 以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸為原料制備的絲素蛋白/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體表面及內(nèi)部為多孔結構，孔的分布均勻，具有肝細胞特異性，適合肝細胞高密度培養(yǎng)，是較為理想的細胞載體材料。大孔微載體與C3A細胞共培養(yǎng)能更好的維持培養(yǎng)的C3A細胞活性及功能，以第3天的功能