磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)對乙型肝炎病毒表面抗原表達的影響.pdf

1、對大多數在宿主細胞核內復制的病毒來說，病毒RNA輸出（RNAexport）是其基因轉錄后調節(jié)的重要步驟之一。1993年在HBV基因組上發(fā)現的一個片段（1151nt-1684nt）被定義為乙型肝炎病毒（HBV）轉錄后調節(jié)元件PRE（HBVpost-transcriptionalregulatoryelement，HPRE）。現有的研究認為其具有輔助轉錄產物從細胞核向細胞漿運輸的功能，但機制尚未清楚。Zang等人用帶電泳遷移率變動分析（EM

2、SA）發(fā)現兩種細胞蛋白能夠與HPRE相互作用，其中一個35kDa的蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。但GAPDH如何影響HBV的復制和表達，目前還沒有具體報道。本實驗的研究目的在于從體外驗證GAPDH與HPRE-RNA的結合作用，利用檢測系統(tǒng)pDM138-HPRE探討GAPDH在HPRE轉錄后調節(jié)的作用，然后過量表達GAPDH于HepG22.2.15細胞和瞬時表達HBs的細胞中，檢測HBs表達量來闡明GAPDH在HBV的轉錄后

3、調節(jié)機制中的功能。 主要研究方法和研究結果： 1.用線性化pGEM-HPRE質粒作為模板，在Biotion標記的堿基體系中用T7RNA聚合酶，以體外轉錄的方法合成HPRE-BiotinRNA。在BL21（DE3）細菌里誘導大量表達重組體pET32a（+）-GAPDH的GAPDH-His蛋白，獲得大量56KDa的蛋白，再采用Ni2+-NTA樹脂親和純化，以SDS-PAGE進行初步鑒定，并以兔抗人GAPDH和抗His標簽抗體

4、來進行Westernblot蛋白鑒定。 2.利用M-280Streptavidin磁珠和Biotin的特異性結合，可用磁力座分離復合物的特性，將洗滌后的沉淀復合物做WesternBlot鑒定。用抗His和抗GAPDH單克隆抗體檢測，實驗組GAPDH-His+HPRE-BiotinRNA能形成復合物，可鑒定出目的蛋白條帶，而對照組His+HPRE-BiotinRNA則沒有條帶出現。由此證明GAPDH-His蛋白能夠與HPRERNA

5、結合。 3.將表達人類GAPDH基因的真核表達質粒pcDNA3.1（+）-GAPDH，與含CAT報告基因的pDM138及pDM138-HPRE和表達綠色熒光蛋白（GFP）的pEGFP-N1分組共轉染293T細胞，轉染48小時后通過流式細胞儀測定pEGFP-N1表達的GFP，來評估轉染效率。用ELISA方法檢測報告基因CAT的表達來驗證蛋白GAPDH對HPRE功能的影響。報告基因CAT表達量經統(tǒng)計學分析顯示：轉染質粒pDM138-

6、HPRE的細胞CAT表達明顯增加；而共轉染質粒pDM138-HPRE和pcDNA3.1（+）-GAPDH，CAT的表達受到明顯抑制（p<0.05）。 4.將GAPDH蛋白的真核表達質粒pcDNA3.1（+）-GAPDH轉染于HepG22.2.15細胞和瞬時表達HBs的293T細胞中，通過ELISA檢測HBs的表達量。應用統(tǒng)計學分析顯示：GAPDH蛋白在HepG22.2.15中過度表達對HBs的表達有明顯的抑制作用（p<0.05）