重組人骨形成蛋白-7活性二聚體制備工藝優(yōu)化.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bonemorphogeneticprotein-7，BMP-7)是一種有較強活性的生物因子，具有強大的誘導骨組織形成和抗腎纖維化作用，臨床上已將rhBMP-7用于骨缺損的修復。 目前獲取rhBMP-7的主要途徑是利用原核表達系統(tǒng)，但它有些不利方面，如菌種易于產生退化、產生無活性的包涵體。對于退化菌種，需要對其復壯；包涵體蛋白質的復性也是基因工程制藥的關鍵步驟，獲得高復性率工藝一直是各個實驗室追求的目標。對r

2、hBMP-7的腎臟治療作用，必須以可溶性注射制劑的形式給藥，其內毒素含量需控制在藥典規(guī)定的注射制劑限值以下。去除內毒素的方法很多，其中廉價、方便、蛋白損失較少的方法是離子交換色譜法。本實驗采用陰離子色譜法去除rhBMP-7蛋白溶液中的內毒素，采用可信度高的的凝膠法測定內毒素含量。尋求實驗周期短、結果穩(wěn)定的體外活性測定方法，是制備可溶性rhBMP-7制劑的重要實驗部分。Balb/c3T3細胞作為rhBMP-7的效應細胞，具有對rhBMP-

3、7靈敏度高、實驗結果穩(wěn)定的優(yōu)點，為rhBMP-7制劑的制備提供了實驗依據。 研究目的： 表達rhBMP-7的工程菌存在表達不穩(wěn)定問題，嚴重影響后續(xù)工作，本論文試圖通過對退化菌種的復壯，以獲得表達量高、穩(wěn)定性好的工程菌。包涵體復性工藝優(yōu)化方面，存在復性率低的問題，本實驗在實驗室老師所用復性方法的基礎上，優(yōu)化加入添加劑的透析復性工藝，以期得到更多的rhBMP-7活性二聚體。探索疏水色譜法對rhBMP-7純化并同時復性。嘗試制

4、作可溶性rhBMP-7蛋白溶液，并探索應用陰離子交換色譜法去除內毒素，以得到rhBMP-7注射制劑，發(fā)揮其對腎臟疾病的治療作用。NIH3T3細胞作為rhBMP-7體外活性測定細胞，具有實驗結果穩(wěn)定性差的缺點，影響可溶性rhBMF-7注射制劑制備的后續(xù)工作。本實驗選擇Bal/c3T3細胞作為rhBMP-7體外測活的效應細胞，旨在建立實驗周期短、結果穩(wěn)定的體外測活方法。 研究方法： 1.對表達rhBMP-7的退化菌種復壯：①

5、檢測退化菌種的質粒丟失情況；②檢測質粒的結構是否正確；③根據檢測結果，更換載體pBV221，重新構建表達rhBMP-7的工程菌；④對重新構建的菌種進行質粒穩(wěn)定性檢測。 2.采用梯度透析法對rhBMP-7復性，并嘗試用疏水色譜法對包涵體蛋白純化并復性。 3.復性所得蛋白溶液經陰離子色譜柱去除內毒素，凝膠法檢測內毒素去除效果。 4.選擇Balb/c3T3細胞作為rhBMP-7體外測活的效應細胞，rhBMP-7對細胞作

6、用時采用含0.4％血清的培養(yǎng)基維持細胞存活，rhBMP-7作用濃度在1ng/ml～60μg/ml范圍內。 研究結果： 1.經檢測，質粒存在于退化菌種。經測定目的基因序列正確，更換載體，重新構建菌種，得到的工程菌目的蛋白表達量達到退化前并且遺傳穩(wěn)定性良好。 2.確定了rhBMP-7透析復性的條件，在4℃、pH8.0條件下，并添加0.4mol/LL-精氨酸的復性液中對rhBMP-7復性效果較好。 3.陰離子色

7、譜柱去除rhBMP-7蛋白溶液中的內毒素，凝膠法測得洗脫液中內毒素含量在注射制劑限值以下。 4.Balb/c3T3細胞作為rhBMP-7體外活性測定的效應細胞，較NIH3T3細胞重復性好、結果穩(wěn)定。 結論： 本實驗室構建的hBMP-7/pBV221/E.coliBL21工程菌發(fā)生退化，BMP-7表達量降低，通過對工程菌復壯，得到的工程菌目的蛋白表達量高、遺傳穩(wěn)定性好。在rhBMP-7透析復性液中加入助溶劑L-精氨