嗜酸氧化亞鐵硫桿菌浸礦過程鐵硫代謝體系的研究.pdf

1、環(huán)境友好高效的生物冶金技術的工業(yè)應用和發(fā)展亟需理論的突破以給生產實踐提供指導，但由于對生物因素了解的局限性及生物冶金體系本身的復雜性一直妨礙了人們對生物冶金體系的全局的理解。本論文運用序列比對與識別、同源模建、進化蹤跡分析、途徑網絡重構、分子模擬、量子化學計算、靜電勢分析、分子對接等生物信息學和分子計算方法，結合蛋白質表達純化和定點突變與表征等技術，對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，簡稱

2、A，f菌)在浸礦過程中利用鐵硫能源驅動生物體合成的鐵硫代謝能量傳遞過程進行了系統(tǒng)地研究，構建了其能量傳遞途徑網絡圖，解釋了單個A，f菌如何浸礦。此外，對硫化礦生物浸出體系及其能量傳遞耦合的產酸問題進行了分析。論文的具體研究內容和結果可概括為五個方面： 一.A.f卣的若干能量傳遞蛋白的結構分析與反應機理預測。 細胞色素c：A.f菌有10個細胞色素c，聚類分析表明它們分成4大同源蛋白類。其中4個周質細胞色素C4家族蛋白的序列

3、結構比較表明位于Cycl的Tyr63和Glu121位點附近的殘基差異決定它們的功能差異。 細胞色素bc1復合體：A.f菌有2個細胞色素bc1復合體，對它們進行了結構模建和機理探討，序列和結構比較顯示了它們在細胞色素b亞基位于血紅素bL輔基近溶液外側的Arg79位點存在差異，這可能導致了它們的正反向功能差異。 終端氧化酶：A.f菌有4個終端氧化酶，對它們進行了結構模建和機理探討，結果表明，細胞色素aa3和ba3復合體的電子

4、供體是周質細胞色素c；細胞色素bo3和bd復合體的電子供體是泛醌。 細胞色素CycA1:模建了三維分子結構，它包含2個血紅素輔基。 細胞色素Cyc2_like蛋白：生物信息學分析表明它是定位于外膜含一個血紅素的高分子量細胞色素蛋白。 硫化物泛醌還原酶(SQR): SQR的結構尚未解析，模建了A.f菌源SQR三維分子結構，并跟黃素(FAD)和泛醌(UQ)進行分子對接，根據這些結果提出了其反應機理。 基因do

5、xDA：對A，f菌doxDA-1與doxDA-2基因的生物信息學分析表明它們是融合基因。 DsbG蛋白：結構模建結果表明，二聚體DsbG蛋白中的兩個單體對稱結合，2個保守的Cys119和Cys122殘基的位置遠離二聚體DsbG蛋白的接觸面，但它們的位置十分接近。 核糖-5-磷酸異構酶：模建了三維分子結構并跟底物R5P進行了分子對接，根據對接結果識別了催化的關鍵殘基，提出了其反應機理。 谷胱甘肽還原酶：模建了三維

6、分子結構并跟底物進行分子對接，根據對接結果識別了催化的關鍵殘基，提出了其反應機理。 二.A，f菌的若干能量傳遞蛋白的結構模建與表達驗證。 銅藍蛋白：靜電勢分析、活性位點量化計算和蛋白質表達定點突變實驗證實殘基Cys138對結合銅原子非常重要。 亞鐵氧化酶(Iro): Iro的結構尚未解析，模建了A.f菌源Iro結構，結果表明它是由4個半胱氨酸配位[Fe4S4]鐵硫簇的高電位鐵硫蛋白(HiPIP)家族蛋白，對離鐵硫

7、簇十分近的Tyr10虛擬突變實驗預測了該位置處的芳香環(huán)對保護鐵硫簇起重大作用，蛋白質的表達純化及定點突變實驗進一步證實了這些結論。 高電位鐵硫蛋白：結構模建表明它含有4個半胱氨酸配位的[Fe4S4]鐵硫簇；蛋白的表達純化實驗表明它含有鐵硫簇活性中心；定點突變實驗進一步證實預測的殘基配位[Fe4S4]鐵硫簇。 亞硫酸還原酶：模建了它的黃素蛋白(SiR-FP)和血紅素蛋白(SiR-HP)的三維分子結構，結果表明，SiR-HP

8、中4個保守的Cys427，Cys433，Cys472和Cys476殘基配位位于單體結構的中心的[Fe4S4]鐵硫簇，血紅素位于鐵硫簇附近。蛋白的表達純化實驗表明SiR-FP含有[Fe4S4]鐵硫簇活性中心和血紅素基團，定點突變實驗證實預測的殘基配位[Fe4S4]鐵硫簇。 APS還原酶：結構模建結果表明它含有由4個保守的Cys110，Cys111，Cys193和Cys196殘基配位[Fe4S4]鐵硫簇，底物APS分子對接的結果顯

9、示其位置就在附近。蛋白的表達純化實驗表明它含有鐵硫簇活性中心。 鐵硫簇組裝供硫蛋白(IscS):模建了A.f菌源IscS的完整的三維分子結構，跟輔因子PLP和底物半胱氨酸分子對接發(fā)現了一些重要殘基；蛋白的表達純化實驗進一步證實A.f菌源的IscS是一個半胱氨酸脫硫酶，它依賴PLP，催化L型半胱氨酸轉變成L型丙氨酸和硫烷硫，為鐵硫簇組裝供硫。 鐵硫簇組裝蛋白(IscA): IscA可能含[Fe4S4]或[Fe2S2]鐵硫簇

10、，結構模建和蛋白的定點突變實驗驗證表明A.f菌源IscA含有由Cys35，Cys99，Cys101和Glu103配位的[Fe4S4]鐵硫簇。 鐵硫簇支架蛋白(IscU)：IscU可能含[Fe4S4]或[Fe2S2]鐵硫簇，結構模建和蛋白的定點突變實驗驗證表明A.f菌源IscU含有由Cys37，Cys63，Cys106和Asp39配位的[Fe2S2]鐵硫簇。 鐵氧還蛋白：鐵氧還蛋白可能含[Fe4S4]，[Fe3S4]或[F

11、e2S2]鐵硫簇，結構模建表明它是由4個半胱氨酸殘基Cys42，Cys48，Cys51和Cys87配位[Fe2S2]的鐵硫蛋白；蛋白的表達純化實驗表明A.f菌源的鐵氧還蛋白正確插入[Fe2S2]鐵硫簇；定點突變實驗進一步證實預測的殘基配位[Fe2S2]鐵硫簇。 超氧化物歧化酶：進行了三維結構模建和進化蹤跡分析，它的活性中心由Cys35，Cys99，Cys101和Glu103配位鐵原子組成；蛋白的表達純化實驗表明它是含鐵超氧化物歧

12、化酶。 中鏈乙酰輔酶A脫氫酶：它及其Y375K突變體與乙酰輔酶A的分子對接比較研究和蛋白表達驗證結果表明，中鏈乙酰輔酶A脫氫酶的Tyr375突變成Lys375使其獲得了乙酰輔酶A氧化酶活性。 乙酰輔酶A氧化酶：分子對接預測和蛋白的表達驗證結果表明Oct-2-en-4-ynoyl-CoA是它的一個特異性抑制劑。 三.A.f菌的若干多拷貝能量傳遞蛋白的分子多樣性。 在三維分子結構層次考察了A.f菌的細胞色素C

13、4類蛋白、銅藍蛋白、高氧還電位鐵硫蛋白、硫化物泛醌還原酶在不同菌株和相同菌株的不同拷貝間的分子多樣性。結果表明相同菌株的不同拷貝蛋白間的差異處于分子的局部；不同菌株同一蛋白間的差異為數個遠離活性中心的殘基，但有少數在活性中心附近發(fā)生突變。 四.A.f菌浸礦過程鐵硫代謝的能量傳遞網絡圖。 對A.fATCC23270全基因組涉及鐵硫代謝能量傳遞的二百多個基因和三十多個多基因操縱子進行了系統(tǒng)地分析，結合前面各部分的研究結果和已

14、有文獻的研究成果，構建了A.f菌浸礦過程鐵硫代謝能量傳遞網絡圖。它包括礦物的分解，溶液中的反應，A.f菌的呼吸鏈、亞鐵氧化、硫代謝、二氧化碳固定、氮氣固定及氫氣利用等部分。圖中對所涉及蛋白的同工酶和多拷貝蛋白的個數及一些重要反應的氧還電勢也進行了標注。通過這個圖，可明白單個A.f菌如何浸礦。 五.硫化礦生物浸出體系的分析及產酸問題。 以生成新物質的流量為切入點，系統(tǒng)地分析了硫化礦生物浸出體系，該體系的變化主要由鐵硫碳氮氧