波形蛋白啟動子去甲基化在TGF-β1誘導腎小管上皮細胞轉分化中的作用研究.pdf

1、 目的：作為慢性腎臟疾病(chronic kidney diseases, CKD)發(fā)展到終末期,甚至完全失去腎臟功能的共同途徑,腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)被認為是這一疾病發(fā)展過程的主要環(huán)節(jié),而上皮-間質轉分化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)又是RIF發(fā)展過程中的重要組成部分,主要表現(xiàn)為腎間質成分的逐漸增多,如波形蛋白(vimentin

2、)、平滑肌肌動蛋白(SMA)、膠原蛋白等,同時伴隨有上皮成分的減少。轉化生長因子β1(TGF-β1)是目前公認的最主要的腎臟促纖維化細胞因子,在一定條件和TGF-β1誘導下,腎小管上皮細胞在體外可以發(fā)生EMT過程。再有,DNA甲基化修飾是表觀遺傳修飾的重要方式,可以通過調控某些基因位點的甲基化狀態(tài)而改變基因表達情況,從而引起相應的細胞表型,甚至功能的變化；甲基化轉移酶1(methyltransferase 1,DNMT1)作為調控基因甲

3、基化狀態(tài)的一種重要酶類,可能參與了某些基因的甲基化修飾過程。因此,我們旨在通過觀察體外 TGF-β1 誘導的大鼠腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells, NRK)轉分化(trans-differentiation)過程中,細胞形態(tài)的改變,以及上皮細胞源性蛋白(AE1/AE3)和間質細胞源性蛋白(vimentin)表達的變化情況,同時檢測 DNMT1 mRNA 和蛋白表達水平及波形蛋白(vimenti

4、n)啟動子甲基化狀態(tài)的變化,從而探討體外誘導的 EMT 過程中可能的發(fā)生機制,為進一步研究提供理論基礎。方法：首先,體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞(NRK),將 NRK 細胞分為對照組和實驗組(TGF-β1誘導組),經(jīng)過體外細胞誘導后,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化情況,并 采用免疫細胞化學染色(ICC)的方法觀察兩組細胞廣譜細胞角蛋白(AE1/AE3)及vimentin表達的情況；然后,應用重亞硫酸鹽PCR直接測序(Bisulfite

5、Genomic Sequence, BSP)的方法檢測誘導前、后vimentin啟動子的甲基化狀態(tài)變化；最后,采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和蛋白質免疫印跡(Western blot)方法分別檢測誘導前、后DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白質的表達情況。結果：體外 TGF-β1誘導前、后,NRK 細胞的形態(tài)發(fā)生了不同程度的改變,并趨于間質細胞生長形態(tài)；經(jīng)灰度值測定及統(tǒng)計學分析顯示,體外TGF-β1誘導的NRK細胞轉分化模型

6、中,NRK細胞DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白質表達明顯降低,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時,誘導前、后vimentin啟動子甲基化狀態(tài)發(fā)生改變,誘導后vimentin啟動子呈去甲基化狀態(tài),且vimentin蛋白質表達明顯增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：在體外TGF-β1誘導后,NRK細胞發(fā)生了上皮細胞到間質細胞的表型轉化,主要表現(xiàn)為細胞形態(tài)趨于間質細胞,且出現(xiàn)上皮源性抗原標志(AE1/AE3)表達的降低和

7、間葉源性抗原標志(vimentin)表達的升高；誘導前、后 NRK細胞 vimentin 表達量的明顯升高可能與其啟動子區(qū),即包括轉錄起始位點附近靠近第一個外顯子的 200-300bp 序列在內(nèi)的某些基因位點甲基化狀態(tài)的變化有關；DNMT1 mRNA及蛋白質表達在誘導前、后的改變提示,其可能在vimentin甲基化狀態(tài)的改變過程中起調控作用,并可能間接影響vimentin蛋白的表達,因此vimentin啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和DNMT1表達