畢赤酵母表達HBsAg的分離純化和鑒定.pdf

1、目的:(1)建立一套以柱層析為主的畢赤酵母表達HBsAg的分離純化工藝，對HBsAg進行生物學性質鑒定;(2)制備重組畢赤酵母乙型肝炎疫苗，檢測重組乙型肝炎疫苗誘導小鼠抗體應答。
　　 方法:(1)畢赤酵母GS115發(fā)酵液高速離心收集菌體，加入細胞裂解液乳化高壓均質機破碎，破碎液經聚乙二醇沉淀法澄清樣品，上清液調整pH值，電導率和自身濃度，DEAE陰離子交換層析，收集合格樣品進行苯基疏水層析，超濾濃縮脫鹽，收集濃縮液，經過凝膠過

2、濾分子篩層析收集純化終產品;(2) Western-blot免疫印跡和還原型SDS-PAGE銀染法檢測HBsAg特異性，掃描電鏡觀察HBsAg顆粒形態(tài)，ELISA法檢測HBsAg含量，高效凝膠分子篩液相方法檢測HBsAg純度;(3) AlCl3溶液緩慢恒速流加NaOH溶液制備Al(OH)3佐劑，純化終產品稀釋至一定濃度加入等體積的鋁佐劑攪拌混勻，制備終濃度為20μg/ml的疫苗成品;(4)腹腔注射BALB/c小鼠重組乙型肝炎疫苗，誘導產

3、生anti-HBs，眼內眥靜脈采血，ELISA法檢測BALB/c小鼠血清中anti-HBs含量，組間數據采用單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果:(1) Western-blot免疫印跡和SDS-PAGE銀染見HBsAg特異性條帶，電鏡掃描見均一的平均直徑為22 nm球形顆粒，ELISA法檢測HBsAg含量為440μg/ml，高效凝膠分子篩液相檢測HBsAg純度超過95.0％;(2) Al(OH)3佐劑高壓滅

4、菌后均一穩(wěn)定，未出現沉淀現象，自制疫苗吸附率為99.995％，達到歐洲藥典標準，(3)動物實驗表明自制疫苗誘導小鼠產生的anti-HBs在第7周達到峰值163±7.384 U/L，與陽性對照組有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 結論:(1)成功建立了一套以柱層析為主的畢赤酵母表達的HBsAg分離純化工藝，純化終產品生物學性質符合歐洲藥典標準;(2)自制乙型肝炎疫苗可誘導小鼠產生高濃度的anti-HBs，其研發(fā)工藝具有進一步生產