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文檔簡介
1、背景與目的:
泡沫細(xì)胞的形成是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)發(fā)病的起始和關(guān)鍵環(huán)節(jié),而氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow-densitylipoprotein,ox-LDL)在此過程中起著核心作用。Ox-LDL通過巨噬細(xì)胞表面受體被細(xì)胞攝取,引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積,同時由于ox-LDL本身的細(xì)胞毒性作用,進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡成為泡沫細(xì)胞。硫化氫(hydrogensulfide,H2S)是繼NO和C
2、O后的第三個氣體信號分子,已有研究表明其可通過多種途徑抑制AS的形成,但其機(jī)制尚未完全闡明。本實驗通過外源性硫化氫供體硫氫化鈉(sodiumhydrosulfide,NaHS)作用于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞Raw264.7,初步探討H2S對Raw264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)吞ox-LDL過程的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。
材料與方法:
1.體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞Raw264.7,分別使用NaHS和內(nèi)源性硫化氫合成酶(CSE)抑制劑PP
3、G預(yù)處理1h,再與Dil紅色熒光標(biāo)記的氧化型低密度脂蛋白(Dil-ox-LDL)共孵育6h。采用激光共聚焦顯微鏡,活細(xì)胞工作站及流式細(xì)胞儀方法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)吞ox-LDL的變化。
2.采用不同濃度(25、50、100、200μmol/L)NaHS對Raw264.7細(xì)胞預(yù)處理1h,及100μmol/LNaHS處理細(xì)胞不同時間(10、30、60、120min),再與ox-LDL共孵育24h,提取細(xì)胞蛋白,采用免疫熒光化學(xué)和蛋白
4、免疫印跡(western-blot)方法檢測ox-LDL受體LOX-1、CD36及C68蛋白的表達(dá)。
3.使用NF-κB信號通路阻斷劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞1h,后加入NaHS100μmol/L處理1h,再與ox-LDL共孵育24h,提取細(xì)胞蛋白,采用蛋白免疫印跡方法檢測LOX-1、CD36蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.外源性NaHS可明顯抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞ox-LDL的過程,而當(dāng)加入內(nèi)源性硫化氫合成酶抑
5、制劑PPG后可明顯增加巨噬細(xì)胞對ox-LDL的內(nèi)吞,表明內(nèi)源性H2S對內(nèi)吞ox-LDL也有作用。
2.NaHS處理后,巨噬細(xì)胞表面ox-LDL受體LOX-1、CD36及C68表達(dá)均有下調(diào),且隨著NaHS濃度升高,處理時間延長,其抑制作用更加明顯,即NaHS呈濃度依賴性、時間依賴性抑制ox-LDL受體的表達(dá)。
3.NaHS抑制LOX-1、CD36蛋白表達(dá)的作用可被NF-κB信號通路阻斷劑PDTC抑制,而ERK1
6、/2通路抑制劑PD98059可促進(jìn)其抑制效應(yīng),表明H2S對LOX-1、CD36表達(dá)的抑制作用是通過NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。
結(jié)論:
1.外源性和內(nèi)源性H2S可抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞ox-LDL。
2.H2S抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞ox-LDL的機(jī)制與下調(diào)ox-LDL受體LOX-1、CD36及C68表達(dá)有關(guān)。
3.H2S下調(diào)ox-LDL受體LOX-1、CD36及C68的表達(dá)可能與NF-κB信號
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