厚殼貽貝新型抗菌肽的分子特征和重組表達(dá).pdf

1、長(zhǎng)久以來(lái),國(guó)際社會(huì)對(duì)抗菌肽的研究主要集中在高等動(dòng)物和一些低等昆蟲方面,海洋抗菌肽研究是近年來(lái)興起的一個(gè)熱點(diǎn)。作者從浙江省重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類厚殼貽貝的血清中分離得到兩種抗菌活性成分,分別命名為Myticusin-1和Mytichitin。通過(guò)Edman降解,獲得了二者成熟肽N端部分序列。為了進(jìn)一步了解二者的基因組成,通過(guò)在NCBI提供的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源核酸序列并以之為模板設(shè)計(jì)引物,成功克隆得到二者的成熟肽編碼序列?！皟刹椒ā笔亲髡呓Y(jié)合逆轉(zhuǎn)錄

2、反應(yīng)自身及逆轉(zhuǎn)錄酶固有的特點(diǎn),并參閱相關(guān)文獻(xiàn)案例設(shè)計(jì)的一套用于克隆cDNA3’端非翻譯區(qū)(UTR)序列的方案,在本實(shí)驗(yàn)中獲得了成功。本研究事先前成功構(gòu)建了厚殼貽貝血細(xì)胞cDNA文庫(kù), Myticusin-15’端非翻譯區(qū)是從文庫(kù)中克隆到的,但并沒(méi)有得到Mytichitin的5’端非翻譯區(qū)。經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)目前已經(jīng)獲得了Myticusin-1cDNA全序列,其ORF編碼生成Myticusin-1前體肽,全長(zhǎng)128aa,前體肽由24個(gè)氨基酸長(zhǎng)度

3、的信號(hào)肽外加104個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的成熟肽組成。編碼Mytichitin成熟肽共56aa,包括6個(gè)半胱氨酸。
　　運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步研究了二者的組織特異性分布以及細(xì)菌誘導(dǎo)后基因豐度變化情況。結(jié)果表明,前者主要表達(dá)場(chǎng)所為血細(xì)胞,并在誘導(dǎo)后36h含量達(dá)到峰值;后者主要表達(dá)場(chǎng)所為性腺,誘導(dǎo)12h后含量達(dá)到峰值。
　　通過(guò)基因工程的手段,成功將二者活性肽基因?qū)雙ET-28a(+)原核表達(dá)載體中。Mytichitin的重組表達(dá)