布魯氏菌蛋白芯片的研制及抗體譜分析.pdf

1、布魯氏菌病是一種危害嚴重的人獸共患傳染病。布魯氏菌是布魯氏菌病的病原體，是一種胞內(nèi)寄生菌。布魯氏菌病的疫苗免疫和準確診斷在布魯氏菌病的預防和控制中起重要作用，但現(xiàn)有的布魯氏菌診斷和疫苗的研究都圍繞在少數(shù)幾個抗原上，因此，研究進展緩慢。根據(jù)布魯氏菌的特點，布魯氏菌中應該還有更多的抗原，可能作為布魯氏菌的診斷和疫苗研究的靶標。能夠誘導機體產(chǎn)生免疫反應和抗體的蛋白很多都是外膜蛋白、分泌蛋白和毒力相關蛋白，因此，從這些蛋白中尋找具有診斷和疫苗研

2、究的候選抗原已成為病原菌研究的重要內(nèi)容。基因組學和蛋白質組學的研究成果，更促進了這類蛋白的研究，也產(chǎn)生了一個新的研究策略，即根據(jù)基因組序列和蛋白質組成的分析，在較小的目標范圍內(nèi)尋找候選蛋白。本研究中，我們結合前期布魯氏菌外膜蛋白質組和分泌蛋白質組的研究結果，以及文獻報道的毒力相關蛋白的研究成果，依據(jù)一定原則，從這些蛋白中挑取蛋白，然后在體外進行克隆表達，并利用蛋白芯片抗體譜方法分析蛋白誘導產(chǎn)生抗體的規(guī)律，尋找可能作為診斷和疫苗研究的候選

3、靶標蛋白。
　　 根據(jù)診斷抗原和保護性抗原的特征，將外膜和分泌蛋白作為研究的重點。根據(jù)布魯氏菌的分泌蛋白質組和外膜蛋白質組，從中篩選出91個外膜蛋白和分泌蛋白。查閱整理已有的毒力相關基因篩選的研究，從中挑取與布魯氏菌毒力相關的基因64個。鞭毛蛋白是重要抗原蛋白，布魯氏菌沒有明顯的鞭毛結構，沒有運動性，但是在布魯氏菌中還存在鞭毛編碼基因，因此本研究選取了29個鞭毛基因。綜合前期已克隆表達的一些已知的抗原，共計207個蛋白作為本研究

4、的候選抗原進行體外克隆表達及抗原性分析。
　　 根據(jù)挑取出來的蛋白基因，設計特異的PCR擴增引物，在上下游引物的5'端分別添加GatewayBP反應的attB重組位點的接頭序列，以及添加接頭的通用引物attB1和attB2。以16M的基因組為模板，進行兩輪PCR擴增，其中第一輪是以特異引物進行擴增，第二輪是以第一輪擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，添加重組位點序列。經(jīng)兩輪擴增，207個基因中有176個能夠成功擴增出預期大小的產(chǎn)物。PCR產(chǎn)

5、物純化后通過BP反應構建入門克隆，獲得156個基因的入門克隆，通過DNA測序對入門克隆的序列進行了確認。通過比較分析4個布魯氏菌蛋白在3個不同表達載體中表達的分析，對適合布魯氏菌蛋白表達的載體進行篩選，確定pHXGWA作為布魯氏菌蛋白表達的載體。提取入門克隆質粒，通過LR反應將基因序列重組到表達載體，構建了表達克隆，蛋白誘導表達結果顯示，共有123個蛋白能夠成功表達。
　　 構建好各基因的表達載體并確定能夠表達之后，對誘導表達的

6、條件，包括誘導劑的濃度、誘導溫度、誘導時間等進行了優(yōu)化和確立，并對各個蛋白的表達形式進行了分析，根據(jù)每個蛋白可溶性表達和包涵體表達的形式和表達量，采取相對應的純化方法進行了純化，最終獲得了全部123個蛋白的純化蛋白。
　　 將純化的蛋白以及不同種屬來源的IgG按一定布局點制在醛基修飾的玻片，研制成布魯氏菌的蛋白芯片，通過對封閉液、一抗?jié)舛?、二抗?jié)舛鹊冗M行摸索，確定了蛋白芯片的反應條件，然后對不同方式免疫的兔血清、免疫小鼠血清和自