Testosterone抗心肌缺血復灌損傷的慢性與急性效應.pdf

1、目的： 大鼠雙側輸精管結扎,睪丸摘除,每天補充雄激素(200μg/100 g體重),建立雄激素替代療法模型.給藥8周后,大鼠開胸取心臟,I.angcndorff裝置上離體灌流,觀察睪酮替代療法的慢性心血管效應;在原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞模型上,MTI法測定細胞存活率.在分離細胞模型上,臺盼藍拒染法測定心肌細胞存活率,視頻跟蹤系統(tǒng)觀察單細胞收縮功能,測定線粒體膜電位和ROS生成情況;以線粒體上的多種通道/孔道為切入點,利用多種工具藥

2、(阻斷劑/開放劑),深入研究睪酮急性心肌保護作用的具體機制. 方法： 1. 大鼠去勢模型和雄激素替代療法雄性Sprague-Dawley大鼠,體重(160～200)g,由浙江省醫(yī)學科學研究院動物中心提供.大鼠麻醉后,用消毒過的刀片將陰囊處切開.輕輕拉出睪丸、附睪頭、附睪尾后,摘除睪丸;結扎輸精管并將其塞回陰囊.兩側相同處理.1周后,給藥組每天補充丙酸睪酮(200μg,100 g體重),去勢組給予相應劑量溶媒. 2

3、. 離體心臟Langendorff灌流雄性SD大鼠斷頭后開胸迅速取出心臟,置于4℃改良Krebs-Henseleit(K-H)液中洗凈血液,迅速轉移、固定于Langendorff灌流裝置,以改良K-H液行常規(guī)恒壓(76mmHg)灌流.各組心臟均穩(wěn)定20 min后,進行實驗處理.結扎冠狀動脈使局部心肌缺血30 min,隨后松開結扎線復灌120 min. 3. 灌流心臟流出液乳酸脫氫酶活性的測定在復灌各時間點收集冠脈流出液,利用分光

4、光度法測定乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)的含量. 4. 心肌梗死面積測定離體心臟復灌120 min后再結扎冠脈,取1﹪伊文思藍經主動脈注入心臟,冷凍后與心臟縱軸垂直切成2mm均勻薄片,采用雙染色法染色,使用Image軟件(NIH)測量相關區(qū)域面積,計算梗死區(qū)占危險區(qū)的比值. 5. 乳鼠心肌細胞培養(yǎng)取生后1-2d的SD大鼠心室肌,剪成1mm<'2>大小后,用含0.1﹪胰蛋白酶和0.05﹪膠原

5、酶Ⅱ的溶液(37℃)消化10 min,收集心肌細胞懸液,并用8 ml含15﹪胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液中和胰酶作用.重復消化收集8-10次,直到心肌組織完全解離,以1200 rpm離心6 min,所得的沉淀用10 Inl DMEM(15﹪胎牛血清)重懸,然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱(95﹪空氣+5﹪CO<,2>,37℃)中預培養(yǎng),1h后懸浮的心肌細胞用200目不銹鋼網過濾. 6. MTT法測定細胞存活率活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使

6、MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)分解產生藍色結晶狀formazan沉淀于細胞內和細胞周圍.其量與細胞數呈正比,也與細胞活力呈正比. 7. 心室肌細胞分離及存活率測定用酶解法分離成年大鼠心室肌細胞.大鼠處死后,迅速取出心臟,置于4℃氧飽和Tyrode氏液中洗凈血液后固定于Langendorff灌流裝置上進行恒流(10 ml/min)灌流(37℃).先以無鈣Trode氏液灌流5 min,再以含Ⅰ型膠

7、原酶0.3 g/L的無鈣Tyrode氏液灌流10mm.將心室肌剪碎,于含0.1﹪BSA的無鈣Tyrode氏液中37℃孵育15 min,細胞懸液用200μm的尼龍網過濾,濾液在無鈣Tyrode氏液中40 min內,每10 min一次逐步復鈣至Ca<'2+>濃度為1.25mmol/L.臺盼藍拒染法測定心肌細胞存活率.0.4﹪臺盼藍染色3 min后,死細胞藍染,活細胞不染色,顯微鏡下分別計算死細胞和活細胞個數. 8. 線粒體膜電位和R

8、OS生成的測定分離的心肌細胞中加入相應的熒光探針(TMRE測定膜電位,DcFH-DA測定.ROS生成量),常溫下避光孵育30 min,然后用Tyrode氏液沖洗2～3次,酶標儀測定其熒光值改變量.將TMRE標記的細胞置于倒置熒光顯微鏡下選取合適的視野成像. 9. 單個心肌細胞收縮的測定將100μl細胞懸液滴于灌流槽中,以95﹪ O<,2>+5﹪CO<,2>飽和的k-H液持續(xù)灌流,流速為2ml/min.在灌流槽中施加頻率為0.2

9、Hz、強度為50 V的電場刺激,待細胞收縮穩(wěn)定15 min后,鏡下選擇橫紋清晰、胞膜光整的桿狀細胞,以計算機輔助的MedEase視頻跟蹤系統(tǒng)檢測單個心室肌細胞收縮參數. 結果： 1.丙酸睪酮替代療法對大鼠體重及抗心肌缺血復灌損傷的慢性作用9周后,與正常對照組比較,去勢組大鼠體重顯著增加,丙酸睪酮(200μg/100 g體重,8周)處理后大鼠體重明顯下降.與去勢組相比,丙酸睪酮處理顯著地減少缺血復灌后心肌梗死面積和冠脈流出

10、液中LDH釋放量. 2. 睪酮對H<,2>O<,2>激引起的心肌細胞存活率的影響與正常組相比,100 μmol/L H<,2>O<,2>處理6 h后,心肌細胞MTT值顯著降低;睪酮預處理(10<'-5>μmol/L,10mm)能夠顯著增加心肌細胞MTT值. 3. 睪酮對H<,2>O<,2>應激引起的心肌細胞存活率的影響以及可能機制不同濃度的H202(10,100,1000 μmol/L.)均能引起心肌細胞存活率的降低,并

11、呈現劑量依賴效應.與正常細胞相比,100 μmoμ/L H<,2>O<,2>處理5 min后,臺盼藍染色法測定的心肌細胞存活率約降低56﹪.睪酮對心肌細胞存活率的作用存在劑量依賴效應.與H<,2>O<,2>組相比,睪酮(10<'-8>,10<'-7>,10<'-6>,10<'-5>,10<'-4>μmol/L)預處理10 min均顯著增加心肌細胞的存活率,而濃度為10<'-9>μmol/L的睪酮無顯著增加心肌細胞的存活率的作用.10<'

12、-5>μmol/L睪酮組增加心肌細胞的存活率的作用與10<'-4>μnol/L睪酮組有顯著差異,而與10<'-4>μmol/L,睪酮組無顯著差異.又根據文獻報道,故后續(xù)實驗我們采用濃度為10<'-4>μnol/L的睪酮處理. H<,2>O<,2>應激前加入線粒體通透性轉換孔開放劑atractyloside(Atr,20μnol/L)預處理20 min或加入5-HI)(100 μmol/L)預處理10 min并于末10 min給予

13、睪酮(10<'-5>μnol/L)處理,均減小睪酮(10<'-5>μmol/L, 10 min)預處理增加心肌細胞存活率的作用. 4. 睪酮對H<,2>O<,2>應激的心肌細胞線粒體TMRE熒光值的影響以及可能機制與對照組相比,H<,2>O<,2>應激(10μmol/L)顯著地增加心肌細胞熒光值,睪酮(10<'-5>μmol/L)預處理能夠減少H<,2>O<,2>應激引起的心肌細胞熒光值△F增加. H<,2>O<,2>應

14、激前加入(20μmol/L)預處理20 min或加入5-HD(100μmol/L)預處理10min并于末10 min給予睪酮(10<'-5>μmol/L)處理,均減小睪酮(10<'-5>μmol/L,10 min)預處理降低心肌細胞熒光值△F的作用. 5. 睪酮對H<,2>O<,2>應激導致的ROS生成量變化的影響及可能機制與對照組相比,H<,2>O<,2>應激組心肌細胞DCF熒光值顯著增加,睪酮(10<'-5>μmol/L)或

15、CsA(0.2μmol/L)預處理能夠減少H<,2>O<,2>應激引起的心肌細胞DCF熒光值增加. H202應激前加入Art(20μmol/L)預處理20 min或加入5-HD(100μmol/L)預處理10min并于末10 min給予睪酮(10<'-5>μmol/L)處理,均減小睪酮(10<'-5>μmol/L,10 min)預處理降低心肌細胞DCF熒光值的作用. 6. 睪酮預處理對H<,2>O<,2>應激引起的心肌細

16、胞收縮動力學變化的影響與對照組相比,H<,2>O<,2>組的+dIJdtmax,-dL/dtmax和dL顯著降低.與H202組相比,睪酮預處理能顯著增加+dL/dtmax和dL;第2 min,顯著增加心肌細胞舒張速度-dL/dtmax,第4,8min沒有明顯變化,第6,10 min顯著增加心肌細胞舒張速度-dL/dtmax. Atr(20/μmol/L,20 min)預處理減小睪酮增加心肌細胞收縮速度+dL/dtmax的作用.

17、 結論： 睪酮具有慢性和急性的抗心肌缺血復灌損傷的心血管保護效應.丙酸睪酮替代療法顯著減少缺血復灌后心肌梗死面積和冠脈流出液中LDH釋放量;睪酮預處理顯著抑制H<,2>O<,2>應激降低培養(yǎng)心肌細胞存活率的作用.在分離心肌細胞H<,2>O<,2>應激模型上,睪酮預處理顯著增加心肌細胞存活率,抑制線粒體膜電位去極化和ROS生成,明顯改善H<,2>O<,2>應激導致的+dL/dtmax和dL降低程度.睪酮的急性心肌保護作用可能