弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白的表達(dá)及相互作用蛋白的篩選.pdf

1、弓形蟲(chóng)病是由剛地弓形蟲(chóng)引起的一種人獸其患寄生蟲(chóng)病，剛地弓形蟲(chóng)隸屬于頂復(fù)門(mén)，可寄生在除紅細(xì)胞外幾乎所有有核細(xì)胞中。據(jù)估計(jì)，全世界約三分之一的人群感染弓形蟲(chóng)。隨著城市的發(fā)展、寵物飼養(yǎng)隊(duì)伍不斷地?cái)U(kuò)大，弓形蟲(chóng)感染的危險(xiǎn)性有上升趨勢(shì)。棒狀體蛋白是弓形蟲(chóng)分泌至宿主細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，棒狀體蛋白定位于宿主細(xì)胞的不同部位，與宿主細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的相互作用。該類(lèi)蛋白可以通過(guò)調(diào)控膜系及骨架結(jié)構(gòu)，影響宿主細(xì)胞的生物活性因子，從而阻斷其內(nèi)在的防御機(jī)制，使弓形

2、蟲(chóng)成功的完成入侵，寄生及增殖等一系列生理過(guò)程。
　　弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白R(shí)op28、Rop38在速殖子階段和緩殖子階段的表達(dá)存在很大差異。本研究通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR成功擴(kuò)增了弓形蟲(chóng)Rop28、Rop38全長(zhǎng)基因，將擴(kuò)增的基因分別克隆至原核表達(dá)載體中，成功在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行了大量表達(dá)，制備了特異性的Rop28、Rop38多克隆抗體。同時(shí)，為鑒定與Rop和Rop38相互作用的蛋白分子，構(gòu)建了Rop28和Rop38真核表達(dá)載體，在293T細(xì)胞中成

3、功進(jìn)行了表達(dá)。
　　本研究構(gòu)建了人源成纖維細(xì)胞(HFF)和T細(xì)胞(CEM) cDNA文庫(kù)，文庫(kù)的滴度分別為，1.2×108 cfu/ml和1.38×108c fu/ml。利用構(gòu)建的酵母誘餌質(zhì)粒篩選HFF文庫(kù)，獲得了與Rop2B、Rop5、Rop16、Rop17、Rop32和Rop38相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。同時(shí)，用Rop38篩選了T細(xì)胞cDNA文庫(kù)。結(jié)果顯示Rop蛋白與宿主細(xì)胞存在著廣泛的相互作用。進(jìn)一步雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Rop2B和

4、7種宿主蛋白存在相互作用;Rop5和7種蛋白存在相互作用;Rop16和14種蛋白存在相互作用;Rop17和7種蛋白存在相互作用; Rop32和12種宿主蛋白相互作用;Rop38和HFF文庫(kù)中11種宿主蛋白存在相互作用，與CEM文庫(kù)中20種蛋白存在相互作用。有文獻(xiàn)表明，過(guò)量表達(dá)Rop38能夠顯著抑制感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。本研究利用Rop38在HFF細(xì)胞文庫(kù)和CEM文庫(kù)均篩選到PRMT7。PRMT7是一種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，是PRMTs家族的重