團(tuán)頭魴結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的克隆和PB轉(zhuǎn)座子、PB-Tgf2復(fù)合轉(zhuǎn)座元件的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因效率研究.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）在我國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)中有著重要的經(jīng)濟(jì)地位，但其屬于不耐低氧的鯉科魚(yú)類(lèi)，在大規(guī)模的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖中極易因?yàn)槿毖跛劳?，從而限制其產(chǎn)量的提高。發(fā)掘主效基因的功能是進(jìn)行水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容，而轉(zhuǎn)座子在功能基因的獲得和研究方面也起到了至關(guān)重要的作用，在水產(chǎn)動(dòng)物分子育種方面有著潛在的應(yīng)用前景。
　　結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tissue growth factor，CT

2、GF）為高度保守的CCN多肽家族中的成員，被命名為CCN2，是一種富含半胱氨酸的分泌肽。CTGF包括了 N-末端分泌肽和四個(gè)多功能結(jié)構(gòu)域，潛在影響多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。研究表明，CCN2與結(jié)合的一些生長(zhǎng)因子之間的相互作用介導(dǎo)了 CCN2對(duì)細(xì)胞增殖、存活、分化、粘附、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的生成產(chǎn)生影響。由于結(jié)締組織生長(zhǎng)因子含有IGFBP結(jié)構(gòu)域，而IGFBP-1的內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子HRE，因此推測(cè)CTGF可能也參與團(tuán)頭魴缺氧應(yīng)答相關(guān)分子

3、機(jī)制。
　　本文獲得了團(tuán)頭魴C(jī)tgfa/b重復(fù)基因cDNA的全長(zhǎng)序列，Ctgfa和Ctgfb基因全長(zhǎng)分別為2153bp和1467bp，開(kāi)放閱讀框分別為1032bp和1056bp，分別編碼343個(gè)和351個(gè)氨基酸。與人類(lèi)和斑馬魚(yú)一樣，團(tuán)頭魴成熟Ctgfa和Ctgfb多肽也包含4個(gè)區(qū)域：IGFBP、VWC、TSP_1和Cys_knot，分別包含的半胱氨酸基團(tuán)數(shù)為11、10、5、11個(gè)。團(tuán)頭魴C(jī)tgfa和Ctgfb的編碼區(qū)相似度為57％

4、，團(tuán)頭魴C(jī)tgfa與人Ctgf和斑馬魚(yú)Ctgfa的相似度都分別為79%和96%，團(tuán)頭魴C(jī)tgfb與人Ctgf和斑馬魚(yú)Ctgfb的相似度都分別為56%和89%，由此可見(jiàn)Ctgfs在進(jìn)化上具有較強(qiáng)的保守性。
　　RT-PCR分析結(jié)果表明，團(tuán)頭魴C(jī)tgfa和Ctgfb基因在不同胚胎時(shí)期具有不同的表達(dá)模式。Ctgfa在0-12hpf階段表達(dá)量逐漸下降，從16hpf開(kāi)始表達(dá)明顯增加，32hpf后表達(dá)量趨于穩(wěn)定；Ctgfb在0-20hpf階段

5、表達(dá)量都較弱，比較恒定且差異不明顯，從24hpf開(kāi)始，表達(dá)量逐漸增加。Ctgfb在0-40hpf胚胎時(shí)期，尤其從24hfp開(kāi)始，表達(dá)量都比Ctgfa低得多。在成年團(tuán)頭魴中，Ctgfa在除心臟、肝臟和性腺外的所有組織中均有表達(dá)，而Ctgfb在所有組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量較Ctgfa要弱得多，在腦和鰓中Ctgfa和Ctgfb的表達(dá)量都是所有組織中最多的。整胚原位雜交結(jié)果顯示，在團(tuán)頭魴胚胎中 Ctgfa mRNA在后腦、脊索中表達(dá)，Ctgfb

6、 mRNA主要在脊索中表達(dá)，但表達(dá)量要少于Ctgfa。
　　本文還開(kāi)展了PiggyBac轉(zhuǎn)座子和PB-Tgf2復(fù)合轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)基因效率研究。分別構(gòu)建了帶有2種不同啟動(dòng)子的供體質(zhì)粒pPBs-EF1α-eGFP和pPBs-Tgf2-RPrmP-eGFP，以及輔助質(zhì)粒pCS2-PBTP，將供體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶mRNA共同注射到團(tuán)頭魴的受精卵中。PCR顯示，這兩種轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在團(tuán)頭魴成魚(yú)基因組中的整合效率分別為為53.04%和32.14