神經(jīng)干細胞介導(dǎo)的HSV-tk-GCV系統(tǒng)對顱內(nèi)惡性腫瘤殺傷作用的研究.pdf

1、前言與目的：由于顱內(nèi)惡性腫瘤具有侵潤性生長的特性,目前治療手段如手術(shù)、放療、化療等難以完全清除侵潤到周邊正常腦組織中的腫瘤細胞,而正是周邊侵潤的腫瘤細胞導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā),且放化療副作用大,效果不佳,預(yù)后極差。
　　 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,基因治療已成為人們關(guān)注的新的治療手段,其中單純皰疹病毒腺苷激酶/更昔洛韋系統(tǒng)(herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir,HSV-tk/GC

2、V)是最有希望,研究最廣泛的策略之一。其原理是在腫瘤細胞中導(dǎo)入tk基因,tk基因表達的腺苷激酶可以將無毒的更昔洛韋在腫瘤局部磷酸化為一磷酸核苷,后者在細胞內(nèi)激酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿岷宋?再繼續(xù)磷酸化為具細胞毒性的三磷酸核苷,抑制多聚酶活性,并競爭性摻入細胞DNA鏈中,引起堿基配對錯誤、斷裂,阻礙DNA復(fù)制,抑制細胞分裂,最終導(dǎo)致細胞死亡。由于有毒藥物只在腫瘤局部發(fā)揮作用,毒副作用小,其臨床應(yīng)用的安全性已得到證實,但臨床實驗中對腫瘤的治療效

3、果并不佳,患者生存期并沒得到延長。因為細胞外的病毒載體只能靠被動擴散,無法移動到離接種點太遠的距離,而膠質(zhì)瘤細胞能侵襲到很遠的區(qū)域。
　　 神經(jīng)干細胞具有向多種顱內(nèi)惡性腫瘤細胞遷移的特性,是基因治療的理想載體。在我們以前的研究中,我們使用原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞做載體,介導(dǎo)HSV-tk/GCV系統(tǒng)對膠質(zhì)瘤C6細胞做治療,在體內(nèi)外實驗中均取得了令人鼓舞的效果。本實驗中我們進一步使用永生化的神經(jīng)干細胞C17.2做載體,研究其對顱內(nèi)惡性腫

4、瘤的殺傷作用。與原代培養(yǎng)的干細胞相比,其性質(zhì)更加均一、穩(wěn)定,實驗可重復(fù)性更強。
　　 在HSV-tk/GCV自殺基因治療中還存在一種機制,“旁觀者效應(yīng)”,當(dāng)給予更昔洛韋時,導(dǎo)入tk基因的“陽性細胞”周邊的未導(dǎo)入tk基因的“陰性細胞”也會被一同殺死。旁觀者效應(yīng)的存在進一步增強了HSV-tk/GCV系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用。雖然其具體機制尚不明確,但日前大多認為旁觀者效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是細胞間縫隙連接(GJ),GJ由細胞膜上的同類連接蛋白(

5、Connexin,Cx)構(gòu)成。自殺基因產(chǎn)物通過細胞間的縫隙連接(GJ)到達鄰近細胞,引起腫瘤細胞死亡。膠質(zhì)瘤中最主要的是Cx43,但在腫瘤細胞中Cx的表達往往較少或者缺失,導(dǎo)致旁觀者效應(yīng)低下,HSV-tk/GCV系統(tǒng)抗腫瘤效果不佳。本研究中,我們使用全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)誘導(dǎo)C6細胞中Cx43的表達,實驗證明,ATRA能進一步增加C6細胞間Cx43的表達,增強HSV-tk/GCV系統(tǒng)對C

6、6細胞的殺傷作用。
　　 材料與方法：
　　 (一)實驗材料永生化神經(jīng)干細胞系C17-2由徐海偉教授惠贈(中國第三軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室)。C6、Daoy細胞系購自ATCC(American Tumor Cell Collection),融合了潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和1型單純皰疹病毒腺苷激酶基因的質(zhì)粒tgCMV/HyTK由中國廣州生物醫(yī)學(xué)公司提供。DMEM、胎牛血清、馬血清購自Gibco公司。潮霉素B、MTT、DMSO、AT

7、RA、羅氏黃購自Sigma公司,Lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司,BALB/c雄性裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)研究院動物研究所。兔多克隆抗體Cx43,β-actin購自Santa Cruz公司。山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG購自中國北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
　　 (二)實驗方法
　　 1、細胞培養(yǎng)永生化神經(jīng)干細胞系C17.2使用DMEM+10％胎牛血清+5％馬血清條件培養(yǎng)基,Daoy、C6細

8、胞使用DMEM+10％胎牛血清條件培養(yǎng)基,所有細胞均在5％CO2,37℃條件下培養(yǎng)。
　　 2、細胞的轉(zhuǎn)染與篩選對數(shù)生長期的C17.2細胞接種于6孔板,細胞貼壁后更換為不含血清的DMEM,加入tgCMV/HyTK和Lipofectamine TM2000,然后加潮霉素B進行篩選,挑選有潮霉素抗性的C17.2-tk單克降細胞分別培養(yǎng),在以后的實驗中應(yīng)用。
　　 3、轉(zhuǎn)染后鑒定取對數(shù)生長期C17.2-tk細胞株接種于96孔板

9、,加入含不同濃度GCV的培養(yǎng)液,7天后檢測細胞存活率,未轉(zhuǎn)染的C17.2細胞做對照。
　　 4、C17.2-tk在體外塒腫瘤Daoy細胞的殺傷作用C17.2-tk與Daoy細胞按不同比例混合,給予不同濃度的GCV,7天后MTT法觀察其對Daoy細胞的殺傷作用。
　　 5、C17.2-tk對Daoy細胞的體內(nèi)殺傷作用應(yīng)用腦立體定向注射儀,將Daoy細胞、轉(zhuǎn)染后的C17.2細胞或兩者按不同比例混合的細胞定向注入裸鼠腦內(nèi)特定位

10、置(前囟后方0.2mm,右側(cè)2mm,硬膜下4mm)。給予生理鹽水對照或GCV,一段時間后猝死,固定腦組織,切片,H-E染色,應(yīng)用NIH圖像分析軟件(rsbweb.nih.gov)計算腫瘤組織體積。同樣方法做另一組裸鼠,觀察其生存期。
　　 6、Daoy、C17.2細胞中Cx43的表達Western-blot檢測:細胞用裂解液處理,BCA法蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5％脫脂奶粉封閉2小時,Cx43及β-act

11、in分別作為一抗反應(yīng)12小時,辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG作為二抗反應(yīng)2小時,化學(xué)發(fā)光法檢測Cx43的表達。
　　 免疫熒光檢測:細胞在蓋玻片上長成單層,用4％的多聚甲醛固定,10％的馬血清封閉30分鐘,Cx43抗體孵育,山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗孵育。PI染色,避光條件下熒光顯微鏡下觀察Cx43的表達。
　　 7、ATRA對C6細胞生長的抑制作用及對C17.2-tk/GCV系統(tǒng)抗腫瘤的增強作用C6細胞接種于96孔

12、板,加不同濃度的ATRA每2天換液一次,5天后MTT法測細胞存活率。C17.2-tk與C6細胞按不同比例混合,單獨加入GCV或ATRA聯(lián)合GCV條件培養(yǎng)液,MTT法測細胞存活率。
　　 8、ATRA增強C6細胞中Cx43的表達ATRA對C6細胞作用3天后,應(yīng)用染料傳輸實驗、Western-blot檢測C6細胞中Cx43的表達。
　　 9、統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均使用SPSS12.0軟件包處理。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準誤表示,均

13、數(shù)使用單因素方差分析和t-檢驗,生存期使用時序檢驗,檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、轉(zhuǎn)染后C17.2-tk細胞對GCV敏感性GCV濃度為0.1μg/ml時,與對照組相比C17.2-tk細胞即出現(xiàn)明顯死亡;隨GCV濃度增加,C17.2-tk細胞死亡逐漸增加,當(dāng)GCV濃度為1μg/ml時C17.2-tk細胞即全部死亡,而此時未經(jīng)轉(zhuǎn)染的C17.2細胞生長良好,即使將GCV濃度提高至100μg/ml(是轉(zhuǎn)染細胞的

14、100倍)C17.2細胞仍沒有出現(xiàn)明顯死亡,兩者存在顯著差異。
　　 2、C17.2-tk/GCV對Daoy細胞的體外殺傷作用當(dāng)GCV濃度為5μg/ml時,殺傷作用達到最大,Daoy細胞的存活率為25％,繼續(xù)提高GCV的濃度不能增強殺傷作用。C1.7.2-tk與Daoy細胞比例低至1:16時,細胞存活率約為75％。
　　 3、C17.2-tk/GCV對Daoy細胞的體內(nèi)殺傷作用C17.2-tk與Daoy共同接種,并且給腹

15、腔注射GCV,腫瘤體積明顯減小,且動物平均生存期明顯延長。C17.2-tk與Daoy比例從1:2到1:8,與對照組相比,腫瘤體積明顯縮小。C17.2-tk與Daoy比例為1:8時平均生存期與對照組相比生存期仍明顯延長。
　　 4、C17.2與Daoy細胞問Cx43表達的檢測Western-blot與免疫熒光結(jié)果均表明,在Daoy和C17.2細胞中Cx43呈相對低表達,轉(zhuǎn)染HSV-tk基因沒有對Cx43的表達造成影響,但當(dāng)C17.

16、2細胞與Daoy細胞共同培養(yǎng)后Cx43的表達明顯增加。
　　 5、C17.2-tk/GCV對C6細胞的體外殺傷作用C17.2-tk與C6細胞比例低至1:16時,仍能對C6細胞的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。
　　 6、ATRA增強C17.2-tk/GCV對C6細胞的殺傷作用單獨應(yīng)用ATRA可以對C6細胞產(chǎn)生殺傷作用,HSV-tk/GCV與ATRA聯(lián)合應(yīng)用增強了C17.2-tk/GCV對C6細胞的殺傷作用。
　　 7、A

17、TRA增加細胞間Cx43的表達染料傳輸實驗及Western-blot檢測結(jié)果均證明,聯(lián)合應(yīng)用ATRA后,C6細胞間Cx43的表達明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 1、C17.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSV-tk基因后對GCV具有很高的敏感性。
　　 2、C17.2神經(jīng)干細胞介導(dǎo)的HSV-tk/GCV系統(tǒng)對顱內(nèi)惡性腫瘤細胞有明顯的殺傷作用。
　　 3、Cx43在Daoy和C17.2細胞中均呈相對低表達,但將兩者混合培養(yǎng)后,