百合主要病毒的分子檢測及脫毒技術研究.pdf

1、百合是一種集觀賞、食用、藥用價值于一身的重要經濟作物。近年來，病毒病的發(fā)生導致百合切花及種球品質嚴重下降，制約了百合生產的發(fā)展。因此，建立快速、準確的百合病毒檢測體系和有效的脫毒體系是減少病毒對百合的危害、恢復種性的關鍵問題之一。 本研究選取對危害百合危害最嚴重的黃瓜花葉病毒(CMV)、百合無癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LMoV)作為研究對象，基于病毒外殼蛋白(CP)核酸序列設計引物，建立了三重 RT-PCR 病毒檢測體系；

2、克隆了北京百合樣品的三種病毒CP基因全序列，并應用該體系對部分百合栽培品種、組培苗及野生種的病毒發(fā)生情況進行了調查；對感染病毒的鐵炮系‘雪皇后’品種進行了系統(tǒng)的脫毒研究。主要研究結果如下： 根據基因庫中CMV、LMoV、LSV的CP基因序列，設計了3對特異引物，通過對擴增條件的優(yōu)化，可從帶有 CMV、LMoV 和 LSV 的樣品中同時擴增出3條與試驗設計大小相符的 657bp(CMV)、428bp(LMoV)、171 bp(LS

3、V)的特異條帶。通過同源關系鑒定可知：本研究所獲得的3種病毒CP基因與GenBank中登錄的其它分離物核苷酸同源性在90％以上，地域差異不顯著，外殼蛋白序列高度保守。 針對3種病毒的CP全序列設計引物，分別進行RT-PCR擴增，獲得鐵炮百合‘雪皇后’品種的3種病毒外殼蛋白基因全序列。片斷大小分別為CMV (657bp)，LMoV (825bp)，LSV (844bp)。通過NCBI的Submission程序在GenBank上登錄

4、，獲得序列號EF158108，EF158109，EF158110。 應用已建立的多重 RT-PCR 方法，對百合田間栽培品種、組培苗和野生群體進行病毒檢測。結果表明：抽檢的9個田間栽培品種均受LMoV 和 LSV復合侵染，病毒在同一栽培區(qū)域內相互傳播，使該栽培區(qū)域的百合全部感染病毒。抽檢的8個組培苗品種中，3個樣品LSV呈陽性，證明該方法可以用于脫毒組培苗的病毒檢測。對岷江百合(Lilium regale)7個群體的檢測結果表明

5、：采自四川茂縣石大關鄉(xiāng)的樣品，LSV呈陽性。這是國內首次報道在野生種的岷江百合中檢測到該病毒。通過核苷酸同源性分析可知，該岷江百合CP基因序列與其它分離物同源性很高，達到98.5％-99％。 采用莖尖培養(yǎng)與病毒唑相結合的方法，設計莖尖大小與病毒唑濃度的不同組合，最終確定病毒唑濃度4mg/L，莖尖大小在 0.5-0.7mm 范圍內為最優(yōu)。該組合能保證較高的成活率和脫毒率，且操作簡便，莖尖生長周期短，成苗快。 最后本研究初步