睡眠呼吸暫停模式間歇低氧對大鼠淋巴細胞及淋巴細胞與血管內皮細胞相互作用的研究.pdf

1、研究目的與背景:
　　阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是指在睡眠期反復發(fā)生上氣道阻塞并引起呼吸暫停的一種常見病。該病睡眠時反復出現(xiàn)呼吸暫停，伴隨不同程度的間歇低氧(IH)。OSAS是一種全身系統(tǒng)性疾病，炎癥和氧化應激是其主要特征，對心血管系統(tǒng)的損害已得到國內外呼吸和心血管領域的普遍認可和關注。白細胞與內皮細胞黏附可導致內皮細胞損傷，在內皮功能障礙導致的心血管合并癥中發(fā)揮重要作用。目前認為OSAS模式IH激活的中性粒細胞及中性粒

2、細胞與血管內皮細胞的相互作用可引起一系列炎癥介質的變化，但迄今IH對淋巴細胞作用研究甚少，淋巴細胞與內皮細胞的黏附及相互作用導致內皮損傷等機制尚不清楚。研究表明在OSAS中，IH能夠激活單核細胞，進而促使黏附分子和ROS的產生，且單核細胞對內皮細胞的黏附活性顯著增強，提示在OSAS損傷內皮細胞機制中單核細胞具有重要的功能。基于以上結果我們假設IH誘導大鼠循環(huán)血中淋巴細胞的激活，激活的淋巴細胞與內皮細胞黏附增加，并進一步激活內皮細胞，釋放

3、促炎細胞因子TNF-α、IL-8、CRP和ICAM-1等，同時氧化及抗氧化狀態(tài)失衡，炎性介質以接觸依賴的方式誘導內皮細胞的損傷，多種轉錄因子參與內皮細胞損傷及凋亡。為此，本研究模擬OSAS建立IH大鼠模型，觀察IH模型大鼠淋巴細胞及亞型的凋亡，檢測淋巴細胞與內皮細胞共培養(yǎng)炎性因子及氧化應激的水平，同時檢測參與內皮細胞凋亡及通路的信號蛋白，最后探討抗氧化劑干預效果，為臨床OSAS合并癥的發(fā)病機制提供理論依據。
　　內容：
　　

4、1. IH暴露下大鼠淋巴細胞亞群凋亡狀態(tài)及抗氧化劑Tempol干預研究
　　2. IH暴露下大鼠淋巴細胞與血管內皮細胞共培養(yǎng)后炎癥及氧化應激程度，及內皮細胞凋亡機制的研究。
　　方法：
　　1.將56只雄性Wistar大鼠隨機分為①常氧對照組(NC);②IH4周組(IH4);③IH6周組(IH6);④早期抗氧化干預(IH6T)組;⑤早期生理鹽水干預(IH6N);⑥晚期抗氧化干預組(IH6T2);⑦晚期生理鹽水干預(IH

5、6N2)。每組8只，IH暴露環(huán)境最低氧濃度均為5％，AHI30/h。應用Tempol從暴露開始時及暴露4周后分別進行早期(IH6T組)和晚期(IH6T2組)干預，予生理鹽水干預作對照。暴露結束后，各組大鼠均麻醉后腹主動脈取血，分離純化淋巴細胞，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸，用抗體標記淋巴細胞亞群，流式檢測凋亡。
　　2.使用正常大鼠主動脈內皮細胞，細胞分為常氧對照組及IH組(IH暴露5 h)，淋巴細胞選用大鼠IH6周組(I

6、H6)、早期干預(IH6T)及常氧對照組(NC)，直接接種于已含內皮細胞的孔板中，共培養(yǎng)分為6組：①常氧大鼠淋巴細胞與常氧內皮組(NC+NE)；②常氧大鼠淋巴細胞與IH內皮組(NC+IHE)；③ IH6周大鼠淋巴細胞與常氧內皮組(IH6+NE)；④ IH6周大鼠淋巴細胞與IH內皮組(IH6+IHE)；⑤抗氧化干預大鼠淋巴細胞與常氧內皮(IH6T+NE)；⑥抗氧化干預大鼠淋巴細胞與IH內皮組(IH6T+IHE)。將共培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱內

7、共培養(yǎng)4 h，取上清液離心后分裝待檢測，內皮細胞提取蛋白及mRNA。
　　3.采用ELISA法檢測各上清液CRP、TNF-α、IL-8、ICAM-1、MDA、CAT及SOD的水平，用蛋白印跡法檢測內皮細胞內Caspase3、NF-κB P65、Bcl-2及Bax蛋白的表達。Real-time PCR法檢測內皮細胞內NADPH P22、C-FOS、HIF-1α以及MAPK P38 mRNA表達水平。
　　結果：
　　第一

8、部分：
　　IH6組、IH4組與NC組比較，IH6組與IH4組比較，CD4、CD8淋巴細胞凋亡減少，B、NK淋巴細胞凋亡增多。IH6T、IH6T2組與IH6比較，IH6T與IH6T2比較，CD4、CD8淋巴細胞凋亡增加，B、NK淋巴細胞凋亡減少。IH6T、IH6T2組與NC比較，CD4、CD8淋巴細胞凋亡減少，B、NK淋巴細胞凋亡增多，F(xiàn)值分別為：15.57(CD4)；24.79(CD8)；18.158(B)；21.94(NK)。

9、
　　第二部分結果：
　　1.淋巴細胞與內皮共培養(yǎng)后，IH6+IHE、H6+NE組與NC+NE組，IH6+IHE分別與IH6+NE、NC+IHE相比，NC+IHE組與NC+NE組相比，共培養(yǎng)液CRP、TNF-α、IL-8、ICAM-1及MDA的水平明顯升高，但SOD和CAT明顯下降；IH6T+NE與IH6+NE組，IH6T+IHE與IH6+IHE比較，TNF-α、IL-8、ICAM-1、CRP及 MDA的水平明顯下降，但 S

10、OD和CAT明顯上升；但 IH6T+NE組與NC+NE組，IH6T+IH組 E與NC+IHE組比較，TNF-α、IL-8、ICAM-1、CRP及MDA的水平仍明顯升高，但SOD和CAT明顯下降；F值分別為26.30(TNF-α)、14.048(IL-8)、26.96(ICAM-1)、17.477(CRP)、76.75(MDA)、18.76(SOD)及28.30(CAT)。
　　2.淋巴細胞與內皮共培養(yǎng)后，IH6+IHE組、H6+N

11、E組與NC+NE組，IH6+IHE組分別與IH6+NE組、NC+IHE相比，NC+IHE組與NC+NE組相比，內皮細胞表達 NF-κB P65、Caspase-3、Bax蛋白增加，BCL-2蛋白表達減少；IH6T+NE組與IH6+NE組，IH6T+IHE組與IH6+IHE比較，內皮細胞表達NF-κB P65、Caspase-3、Bax蛋白減少，BCL-2蛋白表達增加；但IH6T+NE組與NC+NE組，IH6T+IHE組與NC+IHE比較

12、，內皮細胞表達NF-κB P65、Caspase-3、Bax仍蛋白增加，BCL-2蛋白表達減少；F值分別為82.65(NF-κB P65)、37.68(Caspase-3)、41.009(Bax)、51.72(BCL-2)、60.681(BCL-2/Bax)。
　　3.淋巴細胞與內皮細胞共培養(yǎng)后，IH6+IHE組、H6+NE組與NC+NE組，IH6+IHE組分別與IH6+NE組、NC+IHE組相比，NC+IHE組與NC+NE組相比

13、較，內皮細胞表達NADP P22 mRNA、C-FOS mRNA、HIF-1α、MAPK P38 mRNA增多；IH6T+NE組與IH6+NE組，IH6T+IEH組與IH6+IHE組比較，內皮細胞表達NADPH P22、C-FOS、HIF-1α和MAPK P38 mRNA減少；但IH6T+NE組與NC+NE組，IH6T+IHE組與NC+IHE組比較，內皮細胞表達 NADP P22 mRNA、C-FOS mRNA、HIF-1α、MAPK

14、P38 mRNA仍增多；F值分別為27.64(NADPH P22)、72.772(C-FOS)、30.04(HIF-1α)、43.84(MAPK P38)。
　　結論：
　　1. IH暴露大鼠體內的淋巴細胞凋亡狀態(tài)被改變，并可導致免疫失衡，抗氧化劑干預能夠改善IH的損傷作用。
　　2. IH暴露大鼠淋巴細胞與血管內皮細胞相互作用，導致氧化/抗氧化失衡，血管內皮細胞釋放炎癥因子及細胞損傷與凋亡增加。IH暴露淋巴細胞誘導血