Aβ1-42對大鼠膽堿能神經元NOX2的影響及二氮嗪干預研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以進行性認知功能下降為臨床特征神經退行性疾病，是導致老年人癡呆最常見的原因，然而目前尚沒有令人滿意的治療措施。目前我國AD患者的數(shù)量隨著老齡化的加劇在迅速增長，給社會和家庭帶來沉重的負擔，因此對AD的研究具有重要的意義。
　　老年斑(senile plaque，SP)、神經元纖維纏結以及選擇性神經細胞凋亡是AD特征性的病理改變，而SP形成與β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-

2、protein，Aβ)的沉積有關。研究證實Aβ具有神經毒性，可使細胞內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)增加，使胞膜脂質和蛋白被氧化修飾，導致線粒體功能失調、細胞代謝紊亂，而后者又可加重ROS的生成，加劇氧化應激。氧化應激普遍存在于各種神經變性疾病中，也是AD的重要病理機制之一，然而目前臨床上針對AD的抗氧化治療并未產生令人滿意的效果，對AD氧化應激機制的深入研究將有助于尋找新的治療AD的靶點。
　　

3、由于線粒體內膜電子傳遞鏈可產生ROS，既往一直認為細胞內ROS的主要來源是線粒體，然而近年來越來越多的證據(jù)顯示，NADPH氧化酶(NADPHoxidase，NOX)在細胞內ROS的產生中同樣起重要作用。NOX是由細胞內一組具有氧化活性的蛋白組成的酶復合體，其主要的生物學功能是產生ROS，分布于幾乎所有的器官、組織和細胞。NOX的亞基包括催化亞基gp91phox，調節(jié)亞基p22phox、p47phox，以及p67phox、p40phox、

4、Rac等，其中gp91phox和p22phox存在于胞膜，其他亞基分布于胞漿。而gp91 phox(NOX2)及其同源物NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2被稱為NOX家族。NOX通過生成的ROS參與細胞生理活動的調控，包括細胞生長、分化、凋亡以及細胞骨架重塑等，但在異常狀態(tài)下如缺血缺氧、機械損傷、毒性物質或炎性因子刺激等過度激活可產生大量ROS，可造成氧化應激損傷。NOX的激活需要各種亞基組裝成有活性的復合體

5、后才能發(fā)揮其生物學功能，而胞漿亞基向胞膜遷移并組裝成復合體是NOX激活的基礎，其中p47phox C末端的PRR區(qū)可以與p67phoxC末端的SH3區(qū)結合，從而發(fā)揮募集p67phox、p40phox和Rac的作用。研究顯示NOX參與了AD的病理過程，尤其是NOX2。幾種AD的動物模型研究顯示阻斷NOX2具有神經保護作用。在野生型小鼠大腦皮質，利用Aβ1-40新皮層灌流可導致ROS生成及腦血管調節(jié)紊亂，而Aβ1-40處理的NOX2-/-小

6、鼠未出現(xiàn)ROS升高。將表達APP Swedish突變(Tg2576，可導致Aβ片段聚集)的小鼠與Cybb-/-鼠(NOX2功能缺失)雜交，發(fā)現(xiàn)去除功能性NOX2可抵抗Aβ斑塊的毒性作用，明顯降低氧化應激。研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的神經元和小鼠海馬中，基因沉默p47phox或利用二苯基碘(Diphenylene iodonium，DPI)阻斷NOX2可抑制經NMDA受體誘導的超氧化物生成。以上研究表明NOX2參與了AD的病理過程，但對于在AD中起重

7、要作用的膽堿能神經元中，在AD病理條件下NOX2亞基的表達變化尚未見報道。
　　線粒體在能量代謝及電子鏈傳遞中可產生ROS，在病理條件下可出現(xiàn)代謝紊亂，大量ROS產生，導致氧化應激。腦內線粒體的含量是肝臟或心臟的七倍，諸多研究發(fā)現(xiàn)線粒體參與了AD的病理過程，在氧化應激損傷中起重要的作用。一些基于血管內皮細胞的研究發(fā)現(xiàn)，作為細胞內ROS兩個主要來源，線粒體與NOX之間可能存在相互作用，兩者可能通過產生的ROS而相互激活，導致氧化應激

8、加劇，細胞凋亡。然而在AD的病理條件下，神經元內線粒體與NOX2之間是否也存在相互作用，通過對線粒體進行干預是否可影響NOX2，目前尚未見報道。
　　近年來不少研究表明線粒體ATP敏感性鉀離子通道(MitochondrialATP-sensitive potassium channel，MitoKATP)可能是各種腦預適應的一個觸發(fā)器和（或）效應器。無論是在體內還是體外，MitoKATP均參與預處理對腦的保護作用，且這種保護作用大

9、多數(shù)可被MitoKATP拮抗劑5-羥葵酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)所逆轉。
　　目的:本研究利用Aβ1-42作用原代培養(yǎng)的大鼠膽堿能神經元作為AD的病理模型，用二氮嗪作為MitoKATP通道激活劑，以DPI為NOX2的阻斷劑，對以下問題進行探討:
　　1.觀察Aβ1-42對原代培養(yǎng)膽堿能神經元內ROS和細胞活性的影響以及對NOX2主要亞基表達的影響，探討Aβ1-42致氧化應激的機制。
　　2.觀

10、察DPI對Aβ142作用原代培養(yǎng)膽堿能神經元內ROS生成以及細胞活性的影響，探討NOX2是否參與Aβ誘導的膽堿能神經元細胞內氧化應激。
　　3.觀察預激活MitoKATP對Aβ1-42作用原代培養(yǎng)膽堿能神經元內ROS和細胞活性的影響以及對NOX2主要亞基表達的影響，探討在AD的病理條件下，神經元內線粒體與NOX2之間是否存在相互作用，通過預激活MitoKATP是否可影響神經元NOX2的表達，從而起到抗氧化應激的作用。
　　方

11、法:1.大鼠膽堿能神經元的培養(yǎng)和鑒定:無菌條件下取孕16-18d Wistar胎鼠大腦，解剖顯微鏡下剝取基底前腦組織，去除腦膜和血管等雜質，用0.125％的胰蛋白酶消化，以含10％胎牛血清及2％B27的高糖DMEM培養(yǎng)。膽堿能神經元鑒定采用膽堿乙酰化酶（Choline acetylase，ChAT）免疫細胞化學鑒定。
　　2.試驗分組:隨機分為6個組:對照組、Aβ1-42處理組（2μMAβ1-42處理24h或72h）、二氮嗪預處理

12、+Aβ1-42干預組（500μM二氮嗪預處理1h后加入Aβ142處理24h或72h）、DPI預處理+Aβ1-42干預組（1μM DPI預處理1h后加入Aβ1-42處理24h或72h）、DPI預處理組（1μM DPI預處理1h）、二氮嗪預處理組（500μM二氮嗪預處理1h）;各組又分為24h和72h兩個亞組。
　　3.細胞活性的檢測:膽堿能神經元分組培養(yǎng)并藥物處理后，使用MTT方法檢測細胞活性的變化。
　　4.細胞內ROS及M

13、DA的檢測:用氧化敏感的熒光探針DCFH-DA檢測細胞內ROS的水平，用脂質氧化MDA檢測試劑盒檢測細胞MDA水平的變化。
　　5.NOX2亞基表達的檢測:免疫熒光雙染及免疫印跡觀察干預不同時間后膽堿能神經元NOX2主要亞基gp91 phox和p47phox蛋白表達水平的變化。
　　結果:1.大鼠膽堿能神經元的培養(yǎng)和鑒定:ChAT是乙酰膽堿的合成酶，是突觸前膽堿合成的標志酶，培養(yǎng)的神經元在第7天行ChAT免疫細胞化學染色，結

14、果顯示90％以上為膽堿能神經元。
　　2.通過MTT檢測膽堿能神經細胞活性，結果表明，與對照組相比，Aβ1-42處理組細胞活性較對照組顯著下降(24h亞組P＜0.05，72h亞組P＜0.001)，而二氮嗪或DPI預處理+Aβ1-42干預組與對照組相比24h亞組無明顯差異(P＞0.05)，72h亞組細胞活性明顯下降(P＜0.01)，但較Aβ1-42處理組明顯升高(P＜0.01)，提示具有抵抗Aβ1-42神經毒性的作用。
　　3

15、.免疫熒光雙染及免疫印跡結果顯示，Aβ1-42處理組與對照組相比，gp91phox及p47phox表達顯著升高（24h亞組P＜0.01，72h亞組P＜0.001）;二氮嗪預處理+Aβ1-42干預組（24h亞組）與Aβ1-42處理組(24h亞組)比較gp91phox及p47phox顯著下調(P＜0.01)，與對照組(24h亞組)比較無明顯變化，表明二氮嗪預處理可逆轉Aβ1-42誘導的NOX2表達上調;二氮嗪預處理+Aβ1-42干預組(72

16、h亞組)與Aβ1-42處理組(72h亞組)比較gp91phox及p47phox顯著下調(P＜0.05)，與對照組(72h亞組)比較差異也有統(tǒng)計學意義，表明二氮嗪僅能部分逆轉這種表達上調，但仍有顯著統(tǒng)計學差異。由于NOX2表達增加可導致細胞內ROS生成增加，這些結果表明二氮嗪可能通過降低NOX2的表達來抑制Aβ1-42誘導的ROS生成。
　　4.為證實二氮嗪及DPI預處理可以抑制Aβ1-42導致的氧化應激，我們檢測了Aβ1-42處理

17、膽堿能神經元后ROS及MDA的水平。結果顯示Ah-42處理組膽堿能神經元內ROS及MDA水平較對照組顯著升高（24h亞組P＜0.01，72h亞組P＜0.001），而二氮嗪或DPI預處理+Aβ1-42干預組神經元ROS及MDA的水平較Aβ1-42處理組明顯降低（24h亞組P＜0.05，72h亞組P＜0.01），表明二氮嗪或DPI均可抑制Aβ1-42誘導的ROS及MDA生成，減輕氧化應激。
　　結論:1.Aβ142可導致膽堿能神經元N

18、OX2主要亞基gp91phox和p47phox表達上調，從而導致細胞內ROS生成增加，引起氧化應激。
　　2.DPI可抑制NOX2的活性，降低神經元內ROS的生成，從而抑制Aβ1-42導致的膽堿能神經元氧化應激損傷，表明NOX2參與了Aβ誘導的膽堿能神經元細胞內氧化應激。
　　3.通過二氮嗪預激活MitoKATP可抑制Aβ1-42誘導的膽堿能神經元NOX2的表達上調，減少細胞內ROS的生成，從而起到抗氧化應激的作用，表明在A