桔小實蠅胰蛋白酶酶學性質研究及蛋白酶基因表達模式分析.pdf

1、本學位論文基于桔小實蠅轉錄組數(shù)據(jù)，篩選、鑒定出了了桔小實蠅5個胰蛋白酶基因（BdTry1、BdTry2、BdTry3、BdTry4和BdTry5）、2個天冬氨酸酶基因（BdAsp1、BdAsp2）和2個羧肽酶基因(BdCP1、BdCP2)的全長cDNA序列，在序列分析的基礎上，利用qPCR技術重點解析了這些在桔小實蠅不同發(fā)育階段、取食前后以及受胰蛋白酶抑制劑和高效氯氰菊酯脅迫處理后的應激表達模式，同時，在蛋白水平對相關酶活性進行了檢測。

2、研究結果將有助于明確桔小實蠅蛋白酶基因的功能及其調控機制，為桔小實蠅的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結果如下:
　　1.桔小實蠅9個蛋白酶基因的表達模式分析
　　1.1.桔小實蠅9個蛋白酶基因在不同發(fā)育階段的表達模式分析
　　利用qPCR技術分析桔小實蠅9個蛋白酶基因在幼蟲階段第一、三、五天，蛹和成蟲期的mRNA表達水平。結果顯示，這9個基因的表達高峰均出現(xiàn)在孵化后3-5 d的幼蟲期，化蛹后表達量迅速下降并維持在

3、較低水平;羽化后這些蛋白酶基因的表達量逐漸上升?？傮w來看，9個蛋白酶基因的表達量在幼蟲期最高，成蟲期次之、卵期最低，推測這些基因的表達與桔小實蠅幼蟲、成蟲期的取食行為有密切的關系。
　　1.2.桔小實蠅9個蛋白酶基因在胰蛋白酶抑制劑處理后的表達模式分析
　　利用qPCR技術分析在胰蛋白酶抑制劑處理后桔小實蠅9個蛋白酶基因在成蟲中腸的表達情況。結果表明，經(jīng)抑制劑TLCK(100μg/mL)的處理，9個蛋白酶基因除ASP1外，均

4、出現(xiàn)了2倍以上的上調，而同濃度的SBTI對各基因的影響并不明顯，5個胰蛋白酶基因中只有Try3和Try4出現(xiàn)了顯著的上調，而其余4個基因只有CP2和ASP2基因出現(xiàn)上調。表明桔小實蠅受到胰蛋白酶專性抑制劑脅迫時，體內蛋白酶基因的表達出現(xiàn)了上調的情況，以此抵御抑制劑對蟲體的影響。
　　1.3.饑餓及飼喂條件下桔小實蠅9個蛋白酶基因的表達模式分析
　　以桔小實蠅饑餓24 h后相關基因的表達量作為對照，分析飼喂后，胰蛋白酶基因24

5、 h內表達量的階段性變化，結果表明，除了Try3外，其他基因均在飼喂6h后出現(xiàn)顯著的上調，而在12至18h的時間段出現(xiàn)表達高峰，隨后在24 h以后出現(xiàn)顯著的回落。此外，羧肽酶基因也在飼喂18h后出現(xiàn)了2倍以上的上調現(xiàn)象。推測桔小實蠅對食物的消化高峰出現(xiàn)再取食后18h，并且由胰蛋白酶和羧肽酶等共同參與，是一個多種蛋白酶協(xié)同作用的過程。
　　1.4.高效氯氰菊酯脅迫下桔小實蠅5個胰蛋白酶基因表達模式分析
　　為明確逆境脅迫對桔小

6、實蠅蛋白酶影響，對高效氯氰菊酯脅迫后桔小實蠅5個胰蛋白酶基因的表達模式進行了檢測。結果表明，5個胰蛋白酶基因在脅迫后均出現(xiàn)不同程度的上調，上調倍數(shù)介于1.5-2.3倍不等。說明桔小實蠅會提高體內的能量代謝來抵御逆境的脅迫。
　　2.桔小實蠅胰蛋白酶活性及總蛋白酶活性的測定
　　2.1.桔小實蠅胰蛋白酶活性的測定
　　以BApNA為底物，測定桔小實蠅不同發(fā)育階段以及不同組織的胰蛋白酶活性。結果表明，在桔小實蠅幼蟲、蛹和成

7、蟲3個發(fā)育階段中，幼蟲期的胰蛋白酶活性最高;在幼蟲的3個組織中（表皮、中腸和脂肪體），中腸胰蛋白酶活性最高。說明桔小實蠅胰蛋白酶主要在幼蟲的中腸發(fā)揮作用。
　　2.2.高效氯氰菊酯脅迫下桔小實蠅胰蛋白酶活性測定
　　以含0.33μg/g高效氯氰菊酯的飼料飼喂桔小實蠅幼蟲5d后，分別以BApNA和TAME為底物檢測幼蟲中腸胰蛋白酶的酯水解活性和酰胺水解活性。結果顯示，在高效氯氰菊酯的脅迫下，幼蟲胰蛋白酶的酯水解活性和酰胺水解活

8、性都顯著升高。說明桔小實蠅受到藥劑脅迫后體內消化酶活性出現(xiàn)了增強。
　　2.3.蛋白抑制劑處理后桔小實蠅胰蛋白酶及總蛋白酶活性測定
　　以含100μg/mL胰蛋白酶專性抑制劑TLCK和SBTI的飼料飼喂剛羽化的成蟲5d，測定成蟲中腸的胰蛋白酶及總蛋白酶活性。結果顯示，抑制劑處理后成蟲中腸的胰蛋白酶酶活被顯著抑制，且抑制率達到70％。但是，總蛋白酶活性卻保持恒定。說明桔小實蠅在受到胰蛋白酶抑制劑脅迫時，通過其它蛋白酶活性的提高