利用轉(zhuǎn)基因鼠研究基因Atoh1-Math1介導的前庭毛細胞再生.pdf

1、目的：體外研究表明在大鼠橢圓囊上皮內(nèi)過量表達基因Atoh1/Math1可以誘導產(chǎn)生新的毛細胞，但相關在體動物研究尚無明確結(jié)論。本研究利用轉(zhuǎn)基因小鼠建立了可在特定時點于前庭上皮內(nèi)過量表達基因Atoh1/Math1的動物模型，擬應用該動物模型進行相關研究以回答如下問題：1.過量表達基因Atoh1/Math1能否在體內(nèi)實驗中誘導產(chǎn)生新的前庭毛細胞；2.在前庭上皮內(nèi)什么類型的細胞具有在基因Atoh1/Math1誘導下轉(zhuǎn)化為毛細胞的能力；3.這種

2、可轉(zhuǎn)化為毛細胞的能力是否隨著組織發(fā)育的不斷成熟而逐漸消失；4.除了促進細胞分化以外，Atoh1/Math1的過量表達是否具有促進細胞分裂增殖的作用；5.能否通過調(diào)節(jié)其他信號通路誘導產(chǎn)生新生的毛細胞。
　　 方法：本研究使用了在強力霉素誘導下能夠定時定位表達外源性Atoh1/Math1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。在該型小鼠體內(nèi)，F(xiàn)oxg1基因使Cre重組酶特異性的表達于小鼠內(nèi)耳上皮；在該組織內(nèi)，Cre重組酶能切除rtTA基因上游的終止框

3、，使rtTA基因表達。若同時在特定的時點用含有強力霉素的食物飼喂小鼠，則rtTA和強力霉素結(jié)合共同作用于外源性Atoh1/Math1基因上游的TRE，啟動Atoh1/Math1基因的表達。本研究首先通過在小鼠生后不同的時點用含有強力霉素的食物和飲水飼喂小鼠，誘導其體內(nèi)的Atoh1/Math1基因表達，觀察過量表達Atoh1/Math1基因在不同時點對小鼠橢圓囊感覺上皮發(fā)育的影響，判定是否有新的毛細胞產(chǎn)生。然后，本研究在用強力霉素誘導At

4、oh1/Math1大量表達的同時，對小鼠皮下注射Brdu，通過對Brdu進行染色，觀察在Atoh1/Math1介導的在體前庭毛細胞再生過程中有無細胞分裂和增殖現(xiàn)象。最后，本實驗通過體外培養(yǎng)技術(shù)，通過藥物抑制Notch、FGF和BMP等信號通路，研究了抑制這些信號通路對毛細胞再生效應的有關作用。
　　 結(jié)果：逆轉(zhuǎn)錄半定量PCR表明，在強力霉素誘導下，基因型為pTM+，foxglcre+，rtTA+的陽性小鼠橢圓囊上皮Atoh1/M

5、ath1基因的mRNA水平要顯著高于基因型為pTM-，foxglcre+，rtTA+的陰性對照小鼠。在本實驗所涉及的最后時點生后第21天，利用Atoh1/Math1-GFP基因作為報告基因，本研究發(fā)現(xiàn)在基因型為pTM+，foxglere+，rtTA+的陽性小鼠橢圓囊上皮內(nèi)，GFP信號不僅存在于毛細胞層，而且大量表達于支持細胞層。而在基因型為pTM-，foxglcre+，rtTA+的陰性小鼠橢圓囊上皮中，GFP僅較多的存在于毛細胞層，在支

6、持細胞層只有個別細胞表達GFP。該結(jié)果表明在出生后第21天，仍可在陽性動物體內(nèi)誘導Atoh1/Math1基因在蛋白水平的過量表達。本實驗研究了P0，P7，P14和P21四個時點在小鼠體內(nèi)過量表達Atoh1/Math1對小鼠橢圓囊感覺上皮發(fā)育造成的影響，結(jié)果表明在新生小鼠的橢圓囊上皮內(nèi)過量表達Atoh1/Math1可在微紋區(qū)及其附近和非感覺區(qū)誘導產(chǎn)生新的毛細胞，隨著生后天數(shù)的不斷延長，產(chǎn)生的新生毛細胞逐漸減少。在P7階段已無法在非感覺區(qū)誘

7、導產(chǎn)生新的毛細胞，在P21階段，則無法在微紋區(qū)及其附近誘導產(chǎn)生新的毛細胞。通過對小鼠皮下注射Brdu并行染色，本研究對Atoh1/Math1介導的前庭毛細胞在體再生過程中的分裂增殖變化進行了分析，結(jié)果表明在過量表達Atoh1/Math1的情況下，新生小鼠橢圓囊感覺上皮存在著活躍的有絲分裂活動，并且部分新生毛細胞為Brdu染色陽性；細胞分裂增殖現(xiàn)象存在于整個橢圓囊上皮，尤以微紋區(qū)及其附近最為顯著。最后，在體外培養(yǎng)實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)通過藥物

8、抑制Notch和FGF信號通路能夠增加橢圓囊感覺上皮內(nèi)表達Atoh1/Math1的細胞數(shù)量，并在橢圓囊微紋區(qū)誘導產(chǎn)生新生的毛細胞，而抑制BMP信號通路則無法誘導產(chǎn)生新生的毛細胞。
　　 結(jié)論：過量表達Atoh1/Math1基因可以在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生新的前庭毛細胞；在橢圓囊上皮內(nèi)位于微紋區(qū)及其附近的支持細胞和位于非感覺區(qū)的細胞具有在Atoh1/Math1作用下轉(zhuǎn)化為毛細胞的能力；這些轉(zhuǎn)化為毛細胞的能力隨著生后時間的不斷延長逐漸消失