轉(zhuǎn)基因高淀粉、高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制及性狀分析.pdf

1、玉米是全世界第一大作物，是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料。在各種作物淀粉中，玉米淀粉具有最佳的化學(xué)組成，全球淀粉產(chǎn)量的80％左右為玉米淀粉。淀粉產(chǎn)量和淀粉組成結(jié)構(gòu)是影響淀粉業(yè)發(fā)展的兩大因素。在普通玉米籽粒中，淀粉含量一般在65％左右，而直鏈淀粉僅占總淀粉的25-30％。高淀粉玉米種植可明顯增加農(nóng)民收益;而高直鏈淀粉不僅具有重要的工業(yè)用途，也是一種具有保健功能的新型膳食纖維。因此，加強(qiáng)高淀粉和/或高直鏈淀粉玉米的培育有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益

2、。我國(guó)高直鏈淀粉玉米種質(zhì)資源十分缺乏，直鏈淀粉主要依賴以昂貴的價(jià)格進(jìn)口。采用常規(guī)育種方法很難打破高直鏈淀粉性狀與其它不良籽粒性狀的連鎖關(guān)系。因此，利用轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)制高淀粉和/或高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。本論文以參與淀粉合成的關(guān)鍵酶基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因策略，開(kāi)展了高淀粉玉米和高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)的創(chuàng)制。
　　SBEⅡRNAi轉(zhuǎn)基因玉米后代性狀分析
　　直鏈淀粉的合成是一個(gè)多酶催化的過(guò)程并且受

3、到復(fù)雜的基因-環(huán)境互作的影響。淀粉分支酶(SBE)在調(diào)控淀粉分支水平中起核心作用。不同SBE家族的同工酶在控制分支點(diǎn)數(shù)目、鏈長(zhǎng)分布以及直鏈淀粉/支鏈淀粉比例中具有清晰的功能分工，其中SBEⅡb的活性大小直接影響玉米胚乳中直鏈淀粉的含量。
　　本工作首先對(duì)不同的SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)玉米株系進(jìn)行了高直鏈淀粉性狀的遺傳穩(wěn)定性分析，研究了SBEⅡa和SBEⅡb活性的降低對(duì)直鏈淀粉含量、淀粉分支鏈鏈長(zhǎng)分布和淀粉粒形態(tài)的影響。在前期工作中，

4、李寧等已通過(guò)分子檢測(cè)、表達(dá)分析以及直鏈淀粉含量的測(cè)定篩選出不同SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)玉米純合株系，論文中所涉及的10個(gè)hpSBEⅡRNA干擾結(jié)構(gòu)以ZmSBEⅡ亞家族為靶標(biāo)，以達(dá)到抑制SBEⅡ活性的目的。這些干擾載體分為兩組，分別用組成型P35S啟動(dòng)子或胚乳特異性啟動(dòng)子P27kD啟動(dòng)其表達(dá)。每組干擾載體中包含:兩個(gè)載體分別以893 bp(bc)或467 bp(bd)的SBEⅡb保守區(qū)序列為靶序列(相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系分別命名為P35bc、P3

5、5bd、P27bc、P27bd)，兩個(gè)載體分別以417 bp SBEⅡα特異區(qū)+295 bp SBEⅡb特異區(qū)的融合片段(ac)或417 bp SBEⅡα特異區(qū)+154 bp SBEⅡb特異區(qū)的融合片段(ad)作為干擾結(jié)構(gòu)的臂序列(相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系分別命名為P35ac、P35ad、P27ac、P27ad)，另外一個(gè)載體以893 bp的SBEⅡb保守區(qū)序列為靶序列并將干擾結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子部分（chalcone synthase intron，

6、CHSA intron）用改造過(guò)的過(guò)氧化氫酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子替換（相應(yīng)的株系命名為P35in'或P27in'）。凝膠滲透色譜法（GPC法）測(cè)定結(jié)果顯示，在各SBEⅡRNAi轉(zhuǎn)基因株系中，P27ac株系的籽粒直鏈淀粉含量增幅最大，占總淀粉含量的55.89％，幾乎是WT植株直鏈淀粉含量的2倍。P27ad株系的直鏈淀粉含量為51.95％，顯著高于P27bc和P27bd轉(zhuǎn)基因株系的直鏈淀粉含量（分別為46.24％和44.78％）。P27bc、

7、P27in'和P27ad株系的直鏈淀粉含量（分別為46.24％、48.26％和51.95％）均明顯高于其相應(yīng)的P35bc、P35in'和P35ad株系（分別為41.86％、45.31％和46.83％）。P35in'和P27in'轉(zhuǎn)基因株系的直鏈淀粉含量（分別為45.31％和48.26％）略高于P35bc和P27bc株系（分別為41.86％和46.24％，其hpRNA載體含有查爾酮合成酶內(nèi)含子）。并且直鏈淀粉含量的增加與各轉(zhuǎn)基因株系ZmS

8、BEⅡ基因表達(dá)量以及SBE酶活性成負(fù)相關(guān)（李寧2011）。這一測(cè)定結(jié)果與李寧等(2011)碘結(jié)合法測(cè)定的結(jié)果基本一致。GPC結(jié)果還顯示與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)株系的籽粒淀粉脫分支后，F(xiàn)1組分包含更多且鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的直鏈淀粉分子，并且組分F2與F3的比例在轉(zhuǎn)基因株系中更高。即轉(zhuǎn)SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)玉米籽粒中，不僅直鏈淀粉含量顯著增加，而且支鏈淀粉中的支鏈的長(zhǎng)度也明顯增加。
　　在轉(zhuǎn)SBEⅡRNAi結(jié)構(gòu)株系胚乳中，隨著直

9、鏈淀粉含量的提高，淀粉粒的形態(tài)也發(fā)生了明顯變化，如表面呈現(xiàn)不規(guī)則的塌陷，淀粉粒大小不均一等特征。在以ZmSBEⅡ保守區(qū)域?yàn)楦蓴_靶序列的轉(zhuǎn)基因株系P35bc、P35in'、P27bc、P27bd和P27in'中，淀粉粒表面呈現(xiàn)出輕微的不規(guī)則突起，有的變?yōu)槎嘟切?而P35ad、P27ac和P27ad株系中淀粉粒表面呈現(xiàn)出較多的凹陷。這些結(jié)果表明，淀粉組成成分比例的改變顯著影響了淀粉粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)也會(huì)影響籽粒中粉質(zhì)胚乳和角質(zhì)胚乳的比例。相

10、比于WT植株，各轉(zhuǎn)基因株系的籽粒大小有不同程度的降低，并且與直鏈淀粉含量成負(fù)相關(guān)。但是，轉(zhuǎn)基因株系的籽粒未發(fā)生嚴(yán)重的皺縮，籽粒性狀明顯不顯著，基本保持了受體自交系楔形馬齒狀籽粒形態(tài)。
　　本工作利用重疊引物延伸法獲得了突變型AGPase大亞基編碼基因Sh2r6hs，選用玉米胚乳特異性啟動(dòng)子P22kD和P27kD分別驅(qū)動(dòng)Sh2r6hs基因和Bt2基因的表達(dá)，構(gòu)建出Sh2r6hs單基因過(guò)表達(dá)載體和與Bt2基因串聯(lián)的過(guò)表達(dá)植物載體，采用

11、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入優(yōu)良自交系昌7-2和鄭58。 PCR和real-time RT-PCR檢測(cè)證明，外源基因在轉(zhuǎn)基因玉米株系中穩(wěn)定遺傳，且表達(dá)穩(wěn)定。經(jīng)多代篩選，選擇出純合株系用以研究Sh2r6hs以及Bt2過(guò)表達(dá)對(duì)玉米胚乳中AGPase酶活性、淀粉合成、籽粒表型及產(chǎn)量的影響。
　　從不同灌漿時(shí)期(10、15、20、25 DAP)的果穗剝?nèi)∽蚜?，?duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平和AGPase酶活性進(jìn)行分析。各株系中Sh2和Bt2的表

12、達(dá)豐度隨著灌漿時(shí)間的增加而增加，在授粉后20天時(shí)達(dá)到最高峰，繼而降低。相比于未轉(zhuǎn)基因受體自交系，入選的各轉(zhuǎn)基因株系目標(biāo)基因的表達(dá)強(qiáng)度均明顯提高，增加幅度在不同株系間有差異。AGPase活性也隨著灌漿的進(jìn)程而增加，在授粉后20天達(dá)到最高峰，隨后下降。入選的轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)GPase酶活性明顯高于受體自交系的。轉(zhuǎn)雙基因株系的酶活性也明顯高于轉(zhuǎn)單一Sh2r6hs基因株系的。測(cè)定授粉后20天籽粒AGPase酶活性，發(fā)現(xiàn)在45℃下各株系A(chǔ)GPase活

13、性較30℃時(shí)降低。
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因純合植株及其受體自交系的成熟籽粒進(jìn)行淀粉含量和百粒重測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與受體自交系昌7-2相比，Sh2r6hs-C-250植株的籽粒淀粉含量由昌7-2的64.18％增加到70.40％，差異達(dá)到顯著水平;雙基因串聯(lián)的轉(zhuǎn)基因株系Sh2r6hsBt2-C-47的籽粒淀粉含量增加到77.05％;在鄭58背景下，雙基因串聯(lián)的轉(zhuǎn)基因株系的淀粉含量由昌7-2的64.9％增加到Sh2r6hsBt2-Z-80株系的77.36

14、％。
　　本工作中，過(guò)表達(dá)突變型大亞基基因Sh2r6hs或與Bt2基因共表達(dá)都能夠提高胚乳AGPase活性、淀粉含量和籽粒產(chǎn)量，雙基因過(guò)表達(dá)時(shí)淀粉含量和籽粒產(chǎn)量相對(duì)增加更高。Sh2r6hs基因與Bt2基因共表達(dá)可形成更多的穩(wěn)定四聚體，減輕高溫脅迫和Pi對(duì)AGPase活性的抑制，促使更多的可溶性糖類(lèi)被合成淀粉，拉動(dòng)碳水化合物從“源組織”向“庫(kù)組織”分配，導(dǎo)致籽粒產(chǎn)量增加。本工作采用Sh2r6hs基因代替Sh2基因的策略進(jìn)行過(guò)表達(dá)材料

15、的創(chuàng)制，既可有效地減輕抑制因子對(duì)AGPase活性的影響，增加淀粉合成，又能促進(jìn)果穗及籽粒性狀的改變，為培育玉米優(yōu)良自交系提供了一個(gè)切實(shí)可行的途徑。
　　過(guò)表達(dá)GBSSⅠ提高籽粒直鏈淀粉含量和產(chǎn)量
　　直鏈淀粉主要是由顆粒結(jié)合型淀粉合成酶GBSSⅠ負(fù)責(zé)合成的。GBSSⅠ功能的完全缺失將導(dǎo)致直鏈淀粉含量嚴(yán)重降低，甚至致使淀粉中僅含有100％的支鏈淀粉。在玉米胚乳中過(guò)表達(dá)GBSSⅠ編碼基因Zm Wx有望提高GBSSⅠ的活性，增加直

16、連淀粉合成。
　　本工作采用RT-PCR方法從玉米胚乳cDNA中克隆出玉米GBSSⅠ編碼基因ZmWx，選用玉米胚乳特異性啟動(dòng)子P27kD驅(qū)動(dòng)其表達(dá)，以除草劑抗性基因αls為選擇標(biāo)記，構(gòu)建出ZmWx單基因過(guò)表達(dá)的植物轉(zhuǎn)化載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖遺傳轉(zhuǎn)化方法，將其轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系昌7-2和鄭58。
　　綜上所述，本論文工作對(duì)采用RNAi技術(shù)獲得的高直鏈淀粉玉米后代的胚乳淀粉組成和淀粉粒形態(tài)進(jìn)行了分析，進(jìn)一步肯定了不同RN

17、Ai結(jié)構(gòu)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制效果;檢測(cè)了高直鏈淀粉性狀的遺傳穩(wěn)定性，獲得了高直鏈淀粉玉米新種質(zhì)。同時(shí)，利用過(guò)表達(dá)突變型AGPase大小亞基的方法創(chuàng)制出淀粉含量和籽粒體積顯著增加的高淀粉玉米新種質(zhì);利用過(guò)表達(dá)ZmWx基因的方法提高了玉米籽粒直鏈淀粉的合成，獲得淀粉含量和直鏈淀粉含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因玉米新種質(zhì)，并通過(guò)雜交聚合的方式實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)突變型AGPase基因和Zm Wx基因在玉米胚乳中共表達(dá)，為進(jìn)一步選育高淀粉、高直鏈淀粉玉米種質(zhì)提供了優(yōu)