鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II在血管緊張素II受體1型活化和信號(hào)傳遞中的作用研究.pdf

1、血管緊張素II(AngII)是重要的致心肌肥厚因子,它可以引起心臟的變時(shí)、變力效應(yīng)及引起細(xì)胞增殖等[1],這些作用大部分都是由AngII受體1型(AT1)來(lái)介導(dǎo)完成的。
　　 鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶(CaMK)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣調(diào)節(jié)蛋白,心臟中主要表達(dá)的異構(gòu)體為CaMKII。有研究發(fā)現(xiàn)在肥大心肌和衰竭心臟中,CaMKII的表達(dá)也是升高的[2]。那么,CaMKII是否存在于AngII-AT1信號(hào)通路上?
　　 我們通過(guò)一系列

2、的實(shí)驗(yàn)證實(shí),在經(jīng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)AT1和CaMKII的COS7細(xì)胞中,AngII可以引起p-ERK活性增高,且p-ERK活性增高程度較單轉(zhuǎn)染AT1質(zhì)粒的細(xì)胞為高;CaMKII與AT1可發(fā)生結(jié)合,但AngII、AT1受體拮抗劑(ARB)對(duì)此種結(jié)合無(wú)明顯影響。而CaMKII的無(wú)功能突變體DN不能傳遞AngII信號(hào)。提示CaMKII引起心肌肥大的作用與AngII經(jīng)AT1傳遞的信號(hào)通路只是部分相關(guān),而主要是通過(guò)其他未知的信號(hào)通路。
　　 總

3、實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)部分:
　　 第一部分建立表達(dá)AT1和CaMKII/DN的轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞
　　 AT1、CaMKII/DN表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。通過(guò)大腸桿菌JM109擴(kuò)增、AMP篩選及試劑盒抽提得到相關(guān)質(zhì)粒,經(jīng)EcoRI+NotI內(nèi)切酶雙消化鑒定AT1,得到目的AT1片段約為1.1kb左右長(zhǎng)度;EcoRI+BamHI內(nèi)切酶雙消化鑒定CaMKII/DN,得到1.8kb左右長(zhǎng)度目的CaMKII/DN質(zhì)粒片段,表明擴(kuò)增成功。通

4、過(guò)磷酸鹽鈣沉淀法將不同質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞內(nèi)。分別提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的胞膜蛋白及胞漿蛋白,免疫印跡法(WB)可測(cè)得AT1及其所帶的HA-tag、CaMKII及其所帶的Vs-tag;免疫熒光法(IF)可測(cè)得細(xì)胞表達(dá)AT1/HA、CaMKII/DN/V5,而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未能測(cè)得相應(yīng)蛋白,表明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論:轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型成功建立。
　　 第二部分測(cè)定雙轉(zhuǎn)染后表達(dá)的AT1+CaMKII/DN對(duì)AngII的p-ERK反應(yīng)

5、性分別給予轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII/DN的細(xì)胞以AngII刺激,WB測(cè)定隨時(shí)間變化胞內(nèi)p-ERK的改變。另給予單轉(zhuǎn)染AT1、CaMKII、DN的細(xì)胞以AngII刺激或ARB預(yù)處理后再AngII刺激,WB測(cè)定胞內(nèi)p-ERK的改變。結(jié)果:經(jīng)AngII刺激,轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII組于7min左右p-ERK活性達(dá)到最高峰,AT1+DN組在7min作用出現(xiàn)一個(gè)明顯的p-ERK活性抑制峰,經(jīng)給予ARB預(yù)處理后這種作用消失;單轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染AT1

6、組出現(xiàn)p-ERK活性升高并可被ARB消除的現(xiàn)象,陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染CaMKII組和轉(zhuǎn)染DN組則無(wú)此現(xiàn)象。結(jié)論:AT1和AT1/CaMKII均可傳遞AngII的肥厚信號(hào),DN及單純CaMKII不能傳遞AngII的肥厚信號(hào)。
　　 第三部分測(cè)定雙轉(zhuǎn)后表達(dá)的AT1和CaMKII/DN在AngII、ARB等處理下的結(jié)合情況
　　 給予轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII/DN的細(xì)胞不同時(shí)間的AngII刺激,處理后提取膜蛋白,標(biāo)化濃度后行免疫共

7、沉淀(co-IP)測(cè)定AT1上結(jié)合的CaMKII/DN情況隨時(shí)間變化情況。然后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn):不處理組(一)、單予AngII刺激組(II)、單予ARB組(R)、先ARB預(yù)處理后再給予AngII組(RII)。Co-IP+WB檢測(cè)AT1上結(jié)合的CaMKII量。統(tǒng)計(jì)分析最終WB條帶灰度值。結(jié)果:時(shí)間曲線顯示從0、1、3、5、7到10min時(shí)AT1上均有CaMKII結(jié)合,5-7min結(jié)合量最高;DN亦可結(jié)合AT1,但未發(fā)現(xiàn)結(jié)合量有隨時(shí)間的漸進(jìn)性變

8、化。分組實(shí)驗(yàn)中II、R及RII組較(一)組均無(wú)明顯差異。結(jié)論:AT1可與CaMKII/DN結(jié)合;AngII及ARB對(duì)AT1上結(jié)合的CaMKII量均不存在影響。
　　 第四部分測(cè)定雙轉(zhuǎn)后AT1和CaMKII/DN經(jīng)AngII、ARB等處理后在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)分布情況
　　 分別給予轉(zhuǎn)染AT1+CaMKII/DN的細(xì)胞以單純AngII、ARB預(yù)處理后AngII刺激等不同干預(yù),按IF方法進(jìn)行目的蛋白標(biāo)記,激光共聚焦顯微鏡下觀察AT