家蠶黃紅繭品系中Cameo2與SCRB15基因的比較研究.pdf

1、蠶絲因具有輕盈、柔軟、光滑、吸濕性好等眾多優(yōu)良性狀而深受人們的喜愛，隨著人們生活水平的提高和環(huán)保意識的增強，健康、環(huán)保的天然彩色織物越來越受到人們的追捧。我國保存有豐富的天然彩色繭資源，色彩豐富（有淡黃、金黃、稻草色、肉色、紅色、銹色和綠色等）。彩色繭絲中含有葉黃素、β-胡蘿卜素、黃酮類色素等，具有抗紫外線、抗氧化、抑菌等特性，對其進行開發(fā)和利用具有重要的經濟價值。
　　目前人們對彩色繭中顏色的形成以及色素轉運調控機制不清楚，要開

2、發(fā)和利用天然彩色繭資源，必須首先搞清家蠶體內色素的轉運調控機制。早期的研究結果表明，Cameo2和SCRB15基因同屬于清道夫受體家族，但是其編碼的蛋白在家蠶絲腺壁上可以特異性的結合不同種類的色素，其中Cameo2負責結合和轉運葉黃素，SCRB15則特異性地結合β-胡蘿卜素。
　　在本研究中，選擇Cameo2和SCRB15這兩個在家蠶黃紅繭品系繭色形成途徑中起關鍵作用的清道夫受體家族的成員作為研究對象，利用常用分子生物學技術，結合

3、生物信息學分析，對二者進行了初步的比較研究。主要結果如下:
　　1、家蠶銹繭基因CRB15與黃繭基因Cameo2全長CDS序列的克隆及序列比對
　　首先檢測了SCRB15與Cameo2在4個黃紅繭品系不同組織的表達模式，發(fā)現(xiàn)在4個品系的絲腺組織，SCRB15基因僅在銹繭品系表達，而Cameo2僅在黃繭品系中表達。接著以銹色繭品系10-200及黃繭品系柬埔寨、03-210的cDNA為模板，分別擴增了銹繭品系的SCRB15與黃繭

4、品系的Cameo2基因的全長CDS序列，發(fā)現(xiàn)SCRB15基因的CDS全長為1515bp，預測編碼504個氨基酸，Cameo2基因的CDS全長為1482bp，預測編碼493個氨基酸。10-200的SCRB15基因的CDS序列與c44相比僅在編碼區(qū)第622位存在1個堿基的差異，而柬埔寨及03-210中Cameo2基因的CDS序列同黃繭品系N4完全一致。
　　2、Cameo2和SCRB15的生物信息學比較分析
　　利用氨基酸序列比

5、對、結構域預測等生物信息學分析方法，發(fā)現(xiàn)兩個基因的氨基酸序列相似性約為27％，SCRB15的第215～289位氨基酸與Cameo2相應位點的序列相似性最低。SCRB15胞外域包含404個氨基酸，C端、N端各有一個短的跨膜區(qū)。Cameo2胞外域包含407個氨基酸，其C端、N端也各有一個短的跨膜區(qū)。
　　利用同源建模的方法，發(fā)現(xiàn)Cameo2和SCRB15胞外域中均預測到一個由反向平行β折疊片構成的桶狀結構，這種結構與B族Ⅰ型清道夫受體

6、(SR-BI)分子內運輸膽固醇酯的通道十分類似，推測該桶狀結構可能對于特定類胡蘿卜素分子的選擇性識別及轉運起重要作用。Cameo2通道結構內有6個位置靠近的酸性和堿性氨基酸殘基，SCRB15通道內有5個靠近的酸性和堿性氨基酸殘基，可能會與特定類胡蘿卜素分子發(fā)生相互作用。SCRB15通道內側兩個關鍵位點的氨基酸殘基側鏈均比Cameo2要大得多，而葉黃素分子比β-胡蘿卜素分子大，推測SCRB15分子胞外域通道不能容納葉黃素分子通過，從而起到

7、對于類胡蘿卜素分子的選擇性作用。
　　3、Cameo2和SCRB15的原核表達、純化及多克隆抗體的制備
　　分別將Cameo2和SCRB15的胞外域部分連入表達載體，將重組質粒轉入BL21菌株進行原核表達，獲得了可溶性蛋白，過柱純化后獲得了較純的重組蛋白。同時利用原核表達獲得的SCRB15的包涵體，進行電洗脫純化后，免疫家兔，制備多克隆抗體，抗體效價大于1∶3200。
　　4、SCRB15的時空表達模式分析
　　

8、利用Western blot技術，在蛋白水平檢測了SCRB15的表達模式，發(fā)現(xiàn)該基因在10-200、03-510、03-520這3個銹繭品系中表達量均很高。分別檢測SCRB15基因在03-520五齡幼蟲不同發(fā)育時期的表達模式后發(fā)現(xiàn)，在五齡第1天的絲腺開始檢測到很少量SCRB15蛋白的存在，隨著絲腺的發(fā)育，SCRB15蛋白的含量逐漸增加，并在五齡第4天含量達到最大值。
　　5、SCRB15胞外域重組蛋白的體外功能驗證
　　利用