二甲雙胍對乳腺癌細胞侵襲遷移的影響及miR-625的調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　1.探討二甲雙胍對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7侵襲遷移的影響。
　　2.研究二甲雙胍刺激乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7后對miR-625表達的影響。
　　3.通過轉(zhuǎn)染miR-625的模擬物及抑制物來探討其對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的侵襲遷移的影響。
　　4.檢測miR-625轉(zhuǎn)染兩株細胞后侵襲遷移相關蛋白及靶基因蛋白的變化，探討靶基因的調(diào)控機制。
　　

2、方法：
　　1.研究以侵襲遷移能力較強的乳腺癌細胞 MDA-MB-231及侵襲遷移能力較弱的乳腺癌細胞MCF-7為研究對象，使用不同濃度的二甲雙胍作用于乳腺癌細胞，48 h、72 h后采用MTT比色法檢測細胞增殖抑制作用，并據(jù)此結果選擇對細胞增殖影響較小的濃度進行以下的侵襲遷移實驗。
　　2.通過Transwell實驗檢測二甲雙胍對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7侵襲遷移的影響，同時使用qRT-PCR檢測二甲雙胍作

3、用于兩株細胞后miR-625的表達。3.利用qRT-PCR方法檢測兩株細胞中miR-625的表達量。
　　4.以 miR-625為檢索詞，通過靶基因預測軟件 TargetScan、PicTar、miRanda和miRbase預測出靶基因，并通過Western blot實驗檢測靶基因蛋白的變化。
　　5.根據(jù)兩株細胞miR-625表達量的差異，將miR-625的模擬物轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞MDA-MB-231，miR-625的抑制物

4、轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞MCF-7，利用Transwell實驗和細胞劃痕實驗檢測其對細胞侵襲遷移的影響。
　　6.將miR-625轉(zhuǎn)染細胞后，利用Western blot實驗檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關蛋白TIMP1和上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)蛋白的變化及初步驗證 miRNA對靶基因的調(diào)控作用。
　　結果：
　　1.二甲雙胍對乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7增殖

5、及侵襲遷移作用的影響
　　MTT結果顯示，二甲雙胍能明顯的抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖能力，而且抑制活性隨著藥物濃度和作用時間的增加而增強，較小濃度的二甲雙胍(2 mmol·L-1)在一定的程度上可以抑制兩株乳腺癌細胞的侵襲遷移能力(P<0.05)。
　　2.二甲雙胍影響乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7細胞中miR-625的表達
　　用二甲雙胍刺激乳腺癌細胞 MDA-MB-231和 M

6、CF-748 h后，提取細胞microRNA，通過qRT-PCR檢測miR-625的表達量，結果顯示，二甲雙胍作用于細胞后miR-625的表達量顯著增高。
　　3.乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7中 miR-625的表達量
　　qRT-PCR檢測乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7中miR-625的表達量，根據(jù)2-△△Ct值進行統(tǒng)計學分析，結果顯示：MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中miR-625的表

7、達量有顯著的差異，MCF-7細胞中miR-625的表達量顯著高于MDA-MB-231細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4. miR-625靶基因的預測及驗證
　　miR-625相關靶基因的生物信息學預測，通過常用的靶基因預測軟件預測出與miR-625相互作用的靶基因，根據(jù)數(shù)據(jù)庫結果顯示，發(fā)現(xiàn)SCAI正是我們的目標靶基因，因此我們就選擇SCAI進行預測的鑒定。
　　5. miR-625轉(zhuǎn)染后對乳腺癌細胞MD

8、A-MB-231、MCF-7侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　根據(jù)qRT-PCR顯示，乳腺癌細胞MDA-MB-231中miR-625的表達量相對較低，而乳腺癌細胞MCF-7中的表達量相對較高，所以我們將miR-625模擬物轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細胞中，miR-625抑制物轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞中，Transwell實驗結果顯示MDA-MB-231細胞中，miR-625組與NC組相比細胞穿膜數(shù)目并沒有顯著變化，而MCF-7細胞中，anti-mi

9、R-625組相對anti-NC組細胞穿膜數(shù)目顯著增多，劃痕實驗顯示：轉(zhuǎn)染miR-625模擬物的MDA-MB-231細胞的遷移能力較陰性對照組相比變化不明顯，轉(zhuǎn)染miR-625抑制物的MCF-7細胞遷移能力較陰性對照組明顯增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6. Western blot實驗檢測miR-625轉(zhuǎn)染后靶基因蛋白及侵襲轉(zhuǎn)移相關蛋白的變化
　　通過上述Transwell實驗可知，miR-625在乳腺癌細胞

10、MCF-7中可能起到了抑制其侵襲遷移的作用，Western blot檢測可知轉(zhuǎn)染 miR-625抑制物的乳腺癌細胞MCF-7，48 h后靶基因SCAI蛋白明顯降低，TIMP1蛋白明顯降低， EMT相關蛋白E-cadherin降低，提示有可能也誘導出現(xiàn)了EMT。
　　結論：
　　1.二甲雙胍能夠抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7的侵襲遷移能力，而且可以使miR-625的表達升高。
　　2. miR-625在高