全反式維甲酸聯(lián)合替莫唑胺對U251細胞增殖和凋亡作用的實驗研究.pdf

1、背景:化療是治療腦膠質(zhì)瘤(Glioma)重要的輔助治療方法之一，但目前膠質(zhì)瘤化療所使用藥物種類有限。口服烷化劑替莫唑胺(temozolomide，TMZ)生物相容性好，能夠透過血腦屏障，是目前臨床上最常應用的抗膠質(zhì)瘤藥物，是治療膠質(zhì)瘤首選的標準化療藥。TMZ進入人體后分解為5-氨基-瞇唑-4-酰胺(AIC)與重氮甲烷，即活性的烷基化物質(zhì)，產(chǎn)生細胞毒性作用，使細胞DNA中鳥嘌呤的N7和O6位置上發(fā)生甲基化，在DNA復制過程中，錯配修復系統(tǒng)

2、不能為第6位氧原子甲基鳥嘌呤找到配對堿基，導致子鏈DNA中有缺口形成。缺口隨細胞分裂而逐漸積累，最終阻礙復制啟動，從而使細胞停滯在G2/M期，細胞發(fā)生凋亡。但是這種作用機制會被膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)的耐藥相關蛋白O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(MGMT)所逆轉，MGMT能修復烷化劑導致的DNA烷基化損傷，這是膠質(zhì)瘤細胞對亞硝脲類藥物及TMZ產(chǎn)生耐藥的主要原因，從而限制了TMZ的抗腫瘤作用。如何運用化療增敏劑提高TMZ對惡性膠質(zhì)瘤的細胞毒作用

3、是近年來研究的一個熱點。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是一種天然誘導劑，能誘導細胞分化、抑制細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡從而具有抗腫瘤作用，已在造血系統(tǒng)腫瘤及其他實體腫瘤（肝癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌等）顯示出其抗腫瘤作用。尤其是用ATRA治療急性早幼粒細胞性白血病效果確切，可誘導完全緩解。有研究表明，ATRA對C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖具有抑制作用，且抑制率隨ATRA濃度和處理時間的延長而增加，具有時間

4、和濃度的依賴性。作為一種脂溶性化合物，ATRA可以通過血腦屏障，并在腦組織內(nèi)濃集，這是其可用于治療腦膠質(zhì)瘤的基礎。目前，維甲酸對膠質(zhì)瘤作用機理還不完全清楚，它涉及到與增殖、分化、凋亡調(diào)節(jié)有關的一整個網(wǎng)絡系統(tǒng)。目前關于ATRA在治療膠質(zhì)瘤方面報道不多，單獨應用時其抗腫瘤作用有限，但有報道證明其通過誘導細胞分化及抑制增殖，可增加其他化療藥物如紫杉醇、柔紅霉素及γ-干擾素等對膠質(zhì)瘤細胞毒作用的敏感性。本實驗以人膠質(zhì)瘤細胞株U251為實驗模型，

5、將ATRA作為TMZ抗腫瘤作用的增敏劑，觀察ATRA與TMZ聯(lián)合作用對U251細胞的生長抑制是否存在協(xié)同作用，ATRA是否對TMZ誘導的凋亡效應具有增敏作用，并通過檢測與細胞分化和凋亡相關的調(diào)控蛋白及細胞表型分子，如CD133表型、Bcl-2、BAX、caspase-3、caspase-8、caspase-9等凋亡蛋白的表達情況初步分析其可能的作用機制，為克服膠質(zhì)瘤細胞對TMZ耐藥、提高TMZ體外抗膠質(zhì)瘤作用的進一步研究提實驗基礎。

6、r>　　 方法:1、細胞培養(yǎng):膠質(zhì)瘤細胞株U251在含10％胎牛血清(Fetal bovineserum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔1-2天換液一次，4-5天傳代一次。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。2、MTT法檢測細胞增殖抑制率:取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后混懸，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞濃度，接種于96孔板，每孔100μl，含5×103個細胞。設對照組、ATRA設10、20、30、40mM的濃度，T

7、MZ設100、200、300、400mM的濃度，每組4個復孔。每次實驗共種植5個板，置于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72、96、120h后棄上清，加入相應濃度的藥物，對照組加入相應濃度的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。每板加藥后置于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h后行MTT比色實驗，加入MTT(5g/L)20μl，孵箱培育4h，棄上清，加入150μl DMSO，搖床振蕩

8、10 min，酶標儀490nm測OD值。繪制生長抑制曲線圖，并做統(tǒng)計學分析。根據(jù)上述實驗結果，選取ATRA濃度為20mM培養(yǎng)48h，棄上清，再加入濃度為TMZ200mM培養(yǎng)48h后，行MTT檢測細胞增殖抑制率，并與兩藥相同濃度作用48h后的抑制率比較。計算細胞生長抑制率％=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100％。3、分組及藥物干預:設空白對照組(等量DMEM/F12培養(yǎng)基加等量DMSO)、ATRA組(20mM)、TMZ組(200m

9、M)、聯(lián)合作用組(ATRA濃度為20mM+TMZ濃度為200mM)。兩藥單用組分別按上述分組加入各藥作用48h;而聯(lián)合用藥采用序貫加藥的方法，先加ATRA(20mM)作用48h，再棄去培養(yǎng)基，加入TMZ(200mM)作用48h。4、劃痕實驗及細胞形態(tài)學變化:以ATRA、TMZ、聯(lián)合用藥組按上述濃度及方法作用于U251細胞，于37℃、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，于第12、24、48h用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。取對數(shù)生長期細胞按1.0

10、×106/ml的密度接種于6孔板中，用含10％ FBS的DMEM/F12培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)24h后待細胞生長至板底80％以上時，以10μl加樣槍頭在每孔正中劃一直線，無菌PBS洗滌3次去除懸浮細胞，按照上述分組加藥培養(yǎng)后，用倒置相差顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍攝照片。5、免疫熒光檢測細胞CD133細胞陽性率取對數(shù)生長期U251細胞接種于6孔板內(nèi)，在培養(yǎng)板孔的底部加入一片處理好的載玻片，讓細胞生長于載玻片上，每孔加入2ml含10％ FBS的D

11、MEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長良好，按上述分組處理，對照組加入等量培養(yǎng)基及DMSO，培養(yǎng)后載玻片撈片，用PBS洗滌蓋玻片3次，多聚甲醛的PBS緩沖液中固定10分鐘，去除甲醛;用PBS緩沖液洗滌細胞三次，每次10分鐘。在0.5％的Triton-X100中浸潤10分鐘，用PBS緩沖液洗滌細胞三次;滴加0.01MPBS1∶10稀釋的正常山羊血清封閉，室溫下10分鐘，棄去液體，滴加0.01M適當稀釋的兔抗人CD133單克隆抗體，4℃下過夜

12、，PBS漂洗2分鐘×3次。用標記FITC熒光素的羊抗兔IgG抗體二抗作用，37℃30分鐘，PBS漂洗5分鐘×4次，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。以495nm熒光激發(fā)，陽性細胞發(fā)出綠色熒光。計算CD133細胞陽性率=CD133陽性細胞/貼壁細胞×100％。6、流式細胞儀測細胞凋亡率:取處于對數(shù)生長期的細胞，消化后傳至6孔板，貼壁生長24h后，按上述分組加藥，每組在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。用DMEM/F12培養(yǎng)基作空白對照

13、，胰酶消化后懸浮細胞，加入PBS漂洗、離心2次，用500μl結合緩沖液(bind buffer)重懸細胞，加入5μl AnnexinV-FIT℃、5μl碘化丙啶(PI)染色液，混勻后冰浴避光放置15min，流式細胞儀檢測，用Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析。以AnnexinV-FITC+PI+和Annexin V-FITC+PI-為凋亡細胞，每次計數(shù)10000個細胞，計算凋亡率。7、Western blot法檢測細胞蛋白表達根據(jù)上述

14、分組及劑量處理細胞后檢測。PBS漂洗細胞兩次，加入預冷的細胞總蛋白提取試劑，作用20min后4℃下12000r/min離心2min，取上清，Bradford法檢測蛋白濃度。在細胞裂解液中加入1/4體積SDS-PAGE緩沖液，每泳道上樣40μg，恒壓電泳分離蛋白后轉移至PVDF膜。室溫下5％脫脂奶封閉30min。分別加入Bcl-2(1∶1500)、Bax(1∶1000)、caspase-3(1∶500)、caspase-8(1∶1000)

15、、caspase-9(1∶500)、β-Actin(1∶1000)一抗，室溫2h，PBST漂洗3次，加入HRP標記的抗兔IgG抗體(1∶2000)室溫孵育45min。PBST洗膜，ECL法顯影。以β-Actin(1∶1000)作為內(nèi)參。用AlphaEaseFC軟件分析每組內(nèi)每個蛋白的灰度值，以同一樣品中目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白的相對含量。8、統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，結果用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，多組

16、間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:1、細胞增殖抑制作用當ATRA濃度為10mM時，作用后24h不能產(chǎn)生抑制細胞增殖作用，相反對細胞增殖有一定促進作用，表現(xiàn)為吸光度增加，抑制率為負值(-13.35±6.84)％;作用48h后開始產(chǎn)生抑制作用，但48h時抑制率低，僅為(13.18±9.46)％。用ATRA濃度為20、30、40mM時隨濃度增加以及作用時間的延長，抑制

17、率逐漸增加，而48h時增加最明顯，隨后生長抑制曲線升高幅度變得平緩，其中以20mM的ATRA抑制率增加最快，達(43.64±5.09)％，與10mM組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。而TMZ隨濃度增加及作用時間延長抑制率逐漸增加;濃度為100mM時抑制率低，在48h時其抑制率僅為(23.37±8.19)％，而200mM時抑制率達(35.77±5.39)％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而兩藥作用72h、96h、120h時抑制率增加

18、均明顯變慢，這三個時間點之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。根據(jù)統(tǒng)計數(shù)值作出兩藥的增殖抑制曲線。我們看到用ATRA濃度為20mM、TMZ濃度為200mM作用48小時后對細胞增殖的抑制效應明顯，故我們隨后選取ATRA濃度為20mM、TMZ濃度為200mM進行分組及聯(lián)合用藥的用藥濃度。在聯(lián)合用藥組中，用ATRA濃度為20mM培養(yǎng)48h，再加入濃度為TMZ200mM培養(yǎng)48h，行MTT檢測細胞增殖抑制率為(76.33±5.65)％，與ATR

19、A組及TMZ組差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而ATRA組與TMZ組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。2、倒置相差顯微鏡下U251細胞形態(tài)變化:對照組U251細胞多數(shù)呈梭形，突觸較多，折光度好，胞漿豐富，邊緣清晰，與培養(yǎng)板黏合緊密。ATRA、TMZ作用12、24、48h后，見多數(shù)細胞變圓、縮小，折光度降低，部分細胞漂浮，隨著時間延長，上述變化越來越明顯。而聯(lián)合用藥組作用96后，可見大部分細胞變圓、縮小、脫壁漂浮，邊緣毛糙，折光度

20、降低，可見胞膜包裹的細胞碎片。在劃痕實驗中，各組均有一條等寬無細胞劃痕區(qū)。按上述分組藥物作用后，對照組細胞遷移能力強，基本覆蓋劃痕區(qū);ATRA、TMZ組也可見細胞的遷移，劃痕寬度減小，但遷移能力弱，僅部分覆蓋劃痕區(qū);聯(lián)合用藥組的細胞未見明顯遷移，細胞劃痕區(qū)與用藥前相比無明顯變化。3、免疫熒光檢測細胞CD133細胞陽性率在495nm熒光激發(fā)下，標記FITC熒光素的二抗在免疫熒光鏡下發(fā)出強烈的綠光，CD133+細胞標記在細胞膜上，熒光鏡下細

21、胞可呈圓形或類圓形，數(shù)量較多時易聚集成簇。按上述各組藥物干預后，對照組CD133細胞陽性率為（7.05±0.27）％;ATRA組陽性率明顯下降，為(0.66±0.30)％;在TMZ組中，其陽性率最高，達(36.32±3.22)％;而在聯(lián)合用藥組中，其陽性率回落，為(4.70±0.52)％。各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。4、ATRA與TMZ對U251細胞的促凋亡作用20 mM ATRA、200mM TMZ作用48h后，流式

22、細胞儀檢測細胞凋亡率，兩藥對U251細胞均有促凋亡作用，凋亡率分別為（24.93±4.58）％、(21.36±3.76)％，而聯(lián)合用藥組促凋亡作用明顯增強，凋亡率達(41.66±5.02)％。兩藥單用組細胞凋亡率均明顯高于對照組(P＜0.01)，而聯(lián)合用藥組細胞凋亡率明顯高于兩藥單用組及對照組(P＜0.01)。說明ATRA可明顯促進TMZ對U251細胞的凋亡作用。兩藥單用組之間對比無明顯統(tǒng)計學差異(P=0.05)。5、Westem bl

23、ot測U251細胞Bcl-2、BAX、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表達結果顯示在各用藥組中BAX、caspase-3、caspase-8、caspase-9均有不同程度表達增高，而在聯(lián)合用藥組中表達最高;而Bcl-2表達相反，在各用藥組中表達下調(diào)，聯(lián)合用藥組最低;各用藥組與對照組比較、聯(lián)合用藥組與兩藥單用組差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而ATRA組與TMZ組兩藥單用組之間Bcl-2比較無統(tǒng)計學意義(

24、P＞0.05)，而Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9在ATRA組表達較TMZ組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 結論:1、在體外實驗中，ATRA、TMZ兩藥單用均可顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞株U251的增殖，抑制細胞遷移能力，當兩藥聯(lián)合應用時上述作用明顯加強。2、ATRA、TMZ對U251膠質(zhì)瘤細胞株的抑制作用隨用藥濃度的增加及作用時間的延長而增強，即具有劑量依賴性及時間依賴性。3、ATRA和

25、TMZ兩藥均能明顯誘導U251細胞凋亡，而序貫應用ATRA及TMZ作用于U251細胞后，能顯著增強誘導凋亡作用，即兩藥聯(lián)合應用具有協(xié)同作用，證明ATRA對TMZ對U251細胞的細胞毒作用具有化療增敏作用。4、ATRA、TMZ對U251細胞的抑制增殖、促進凋亡作用的機制可能與下調(diào)U251細胞內(nèi)Bcl-2、上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9等蛋白表達水平有關，而ATRA對TMZ對U251細胞的化療增敏作用