同種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)回輸治療大鼠糖尿病.pdf

1、目的： 近年來(lái)，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)的患病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)，而且發(fā)病更趨年輕化。目前主要以口服藥物和注射胰島素治療為主，這兩種治療方法均存在弊端。干細(xì)胞是一群較原始的細(xì)胞，它們既具有自我更新的能力，也具有在合適的微環(huán)境里多向分化的潛能，理論上可提供豐富的胰島細(xì)胞來(lái)源，因此干細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞(Insulin-producing cells，IPCs)的研究為糖尿病的治療提供了新

2、的思路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)可能是干細(xì)胞中有希望的候選細(xì)胞，它是一種具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和可塑性的成體干細(xì)胞。許多體外研究已經(jīng)將BM-MSCs成功誘導(dǎo)為IPCs，將其移植到糖尿病大鼠體內(nèi)，可降低血糖。因此，本研究探索高糖條件下，尼克酰胺(Nicotinamide)聯(lián)合Exendin-4是否能將BM-MSCs體外誘導(dǎo)為IPCs，并觀測(cè)誘導(dǎo)成的IPCs回輸至鏈脲

3、佐菌素(Streptozotocin，STZ)大鼠體內(nèi)對(duì)高血糖是否有治療效果。 材料與方法 1、BM-MSCs細(xì)胞的分離提取及誘導(dǎo)在無(wú)菌條件下取3周齡大鼠股骨，利用直接貼壁法分離BM-MSCs，LG-DMEM(5.6mmol/L)培養(yǎng)傳代。取第3代細(xì)胞上清液測(cè)胰島素水平，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-MSCs的表面標(biāo)志。用HG-DMEM(25mmol/L)誘導(dǎo)14天，取上清液測(cè)胰島素水平。加N(10mmol/L)誘導(dǎo)7天，再加E

4、(10nmol/L)誘導(dǎo)7天，取上清液測(cè)胰島素水平。誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行DTZ染色檢驗(yàn)，回輸前用BrdU標(biāo)記細(xì)胞。 2、動(dòng)物分組與處理將28只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組和造模組(正常組8只)。造模組(20只)大鼠一次性腹腔注射1％ST2(50mg/kg)建立糖尿病模型。將造模成功的16只大鼠隨機(jī)分成兩組，即糖尿病組和實(shí)驗(yàn)組。將誘導(dǎo)后并已標(biāo)記的細(xì)胞腹腔回輸至實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)(5.6-6)×105/ml，正常組及糖尿病組注射生理鹽水作

5、為對(duì)照。 3、檢測(cè)指標(biāo)及方法細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)的各階段采集圖像。DTZ染色的細(xì)胞采集圖像。細(xì)胞回輸后每周測(cè)大鼠體重及血糖。給藥前和實(shí)驗(yàn)終止時(shí)各取血測(cè)空腹胰島素(ELISA法)。實(shí)驗(yàn)終止時(shí)取大鼠肝臟、脾臟、胰腺，免疫組織化學(xué)雙染法(SABC法)檢測(cè)其中胰島素和BrdU染色雙陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。經(jīng)圖像采集分析系統(tǒng)對(duì)各組胰腺中胰島素染色陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域占胰島區(qū)域百分比進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1、細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)第13天時(shí)

6、獲得形態(tài)均一的第3代細(xì)胞，增殖能力旺盛。第3代細(xì)胞經(jīng)HG-DMEM培養(yǎng)14天后，細(xì)胞增值能力旺盛并趨向團(tuán)狀、漩渦狀生長(zhǎng)。經(jīng)N誘導(dǎo)7天后再加E誘導(dǎo)7天，細(xì)胞個(gè)體明顯增大，呈多邊形或近圓形，胞漿豐富，胞核變大，經(jīng)DTZ染色后細(xì)胞呈橙紅色。 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果BM-MSCs表達(dá)CD29、CD44陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為95.47％，91.83％；而CD34(造血干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志)、CD45(白細(xì)胞表面共同抗原)僅有微弱表達(dá)

7、，細(xì)胞表達(dá)的百分率分別為1.05％，1.18％。 3、生化及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果經(jīng)藥物誘導(dǎo)后的細(xì)胞上清液胰島素水平顯著高于高糖誘導(dǎo)后(P＜0.01)，而高糖誘導(dǎo)后與低糖培養(yǎng)上清液胰島素水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模成功后實(shí)驗(yàn)組和糖尿病組大鼠血糖及胰島素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)細(xì)胞回輸治療后實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖高于正常組(P＜0.01)低于糖尿病組(P＜0.05)。治療后實(shí)驗(yàn)組大鼠胰島素水平低于正常組(P＜0.05)高于糖尿病組(P＜0.05)。 4、

8、免疫組化及圖像分析結(jié)果實(shí)驗(yàn)終止時(shí)免疫組織化學(xué)檢測(cè)胰腺中胰島素陽(yáng)性細(xì)胞百分比發(fā)現(xiàn)正常組明顯高于其他各組(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組低于正常組但是明顯高于糖尿病組(P＜0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的胰島素和BrdU染色雙陽(yáng)性細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)組的肝臟中發(fā)現(xiàn)少量胰島素和BrdU雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，脾臟中亦發(fā)現(xiàn)少量雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。 結(jié)論： 1、尼克酰胺(Nicotinamide)聯(lián)合Exendin-4可以將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素