蛋白磷酸酯酶2A的活性下調(diào)對戊四氮點燃模型大鼠癇性發(fā)作及海馬苔蘚纖維出芽的促進作用.pdf

1、第一部分 p-tau(Ser262)蛋白在戊四氮點燃模型大鼠海馬中的表達變化及其在海馬苔蘚纖維出芽中的作用研究
　　目的:檢測和分析p-tau(Ser262)及其總tau蛋白在戊四氮點燃顳葉癲癇模型大鼠海馬中的表達變化，并探討其在海馬苔蘚纖維出芽中的作用。
　　方法:150只6-8周齡健康雄性SD大鼠，隨機分為對照組和戊四氮組，它們再隨機分為3天、1周、2周、4周、6周五個時間點的亞組，采用戊四氮(30mg/kg)持續(xù)腹腔注

2、射的方法，建立戊四氮點燃顳葉癲癇模型，相應(yīng)的對照組給予生理鹽水持續(xù)腹腔注射，于每個時間點取材。每次給藥后至少觀察2小時，并用照相儀記錄大鼠發(fā)作情況，以評價造模成功與否。采用免疫組織化學(xué)法檢測p-tau(Ser262)及總tau在對照組及戊四氮組各時間點大鼠海馬中的表達情況;Western blot檢測p-tau(Ser262)及總tau在對照組及戊四氮組各時間點大鼠海馬表達量的變化;熒光定量PCR進一步驗證總tau mRNA的表達變化;

3、Timm染色檢測對照組及戊四氮組各時間點大鼠海馬苔蘚纖維出芽動態(tài)變化。
　　結(jié)果:
　　1.建立了戊四氮點燃顳葉癲癇模型，取得了實驗所需組織標本。
　　2.戊四氮組免疫組化結(jié)果顯示p-tau(Ser262)的表達水平除3天組外均顯著增高(p＜0.001)，表現(xiàn)為1周時間點開始表達升高，隨給藥次數(shù)的增多表達逐漸升高，4周時達到高峰，6周時表達下降至約相當(dāng)于2周時水平，而總tau蛋白在戊四氮點燃模型大鼠海馬的表達與正常對照

4、組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot結(jié)果進一步證實了p-tau(Ser262)在戊四氮點燃模型大鼠海馬中的表達變化，而熒光定量PCR亦證實戊四氮組總tau在其mRNA水平即與對照組無顯著差別(p＞0.05)。
　　3.Timm染色結(jié)果顯示除3天組外戊四氮組余各時間點的苔蘚纖維出芽與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01)，出芽程度隨著給藥次數(shù)的增加而升高，4周時達高峰，之后維持于該水平。苔蘚纖維出芽在各

5、時間點的程度變化與p-tau(Ser262)在癲癇大鼠海馬中的表達模式呈高度一致性，提示p-tau(Ser262)在海馬苔蘚纖維出芽中可能發(fā)揮重要作用。
　　結(jié)論:
　　海馬苔蘚纖維出芽可能是戊四氮點燃模型大鼠癇性發(fā)作的原因。
　　p-tau(Ser262)參與了戊四氮點燃模型大鼠顳葉癲癇的形成。
　　p-tau(Ser262)可能參與戊四氮點燃模型中海馬苔蘚纖維出芽的形成。
　　第二部分蛋白磷酸酯酶2A對

6、戊四氮點燃模型大鼠癇性發(fā)作的作用
　　目的:探討調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)對戊四氮點燃模型大鼠癇性發(fā)作的作用。
　　方法:隨機選取200只6-8周SD雄性大鼠，分為對照組、戊四氮組、空白對照組和硒酸鈉組;對照組和戊四氮組造模同第一部分，硒酸鈉組大鼠先給予硒酸鈉配制飲用水進飲1周，空白對照組則給予等量正常飲用水，1周后硒酸鈉組停止飲用藥物配制用水，隨之兩組均給予戊四氮（30mg/kg）腹腔注射，于注射后

7、第8天，硒酸鈉組大鼠再次給予硒酸鈉飲用水，連用4天，同時進行戊四氮注射，每次注射后觀察大鼠癇性發(fā)作情況并記錄;采用免疫組織化學(xué)法、Westernblot及熒光定量PCR法首先檢測戊四氮組大鼠海馬組織中的PP2A、Methyl-PP2A和p-PP2A的表達變化;再檢測硒酸鈉組及空白對照組大鼠海馬p-PP2A和Methyl-PP2A的表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.硒酸鈉組大鼠的癇性發(fā)作嚴重程度明顯下降，點燃率為25％，空白對照

8、組點燃率為94％。
　　2.戊四氮組p-PP2A的免疫組化及Western blot結(jié)果均顯示除3天時間點外，在余時間點的表達與同時間點對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01)，表現(xiàn)為1周時間點開始表達升高，隨給藥次數(shù)的增多表達逐漸升高，4周時達到高峰，6周時表達下降至約相當(dāng)于1周時水平，Methyl-PP2A的Western blot結(jié)果顯示1周時間點表達開始下降，隨給藥次數(shù)的增多表達逐漸下降，4周時降至最低，

9、6周時維持于該水平，而總PP2A蛋白在戊四氮點燃模型大鼠海馬的表達與正常對照組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　3.硒酸鈉激動組p-PP2A的表達水平于1周、2周及4周均較同時間點空白對照組顯著下降(p＜0.05)，證明硒酸鈉可顯著增加PP2A的活性。與之相應(yīng)，硒酸鈉激動組Methyl-PP2A的表達量在1周、2周及4周較同時間點空白對照組顯著升高(p＜0.05)，進一步證實了硒酸鈉增加了戊四氮點燃模型大鼠海馬的PP2A

10、活性。
　　結(jié)論:
　　PP2A的活性下調(diào)參與了戊四氮點燃模型大鼠顳葉癲癇的發(fā)病機制。
　　硒酸鈉抑制戊四氮模型大鼠癇性發(fā)作的級別，表明PP2A的活性改變與戊四氮點燃模型大鼠癇性發(fā)作的嚴重程度有關(guān)。
　　第三部分蛋白磷酸酯酶2A對戊四氮點燃模型大鼠海馬苔蘚纖維出芽的作用
　　目的:探討蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)對戊四氮點燃模型大鼠海馬p-tau(Ser262)和苔蘚纖維出芽的影響。
　　方法:72只

11、6-8周齡健康雄性SD大鼠，隨機分為空白對照組和硒酸鈉組，分別再隨機分為1周、2周和4周三個亞組，造模同第二部分。利用免疫組化和Western blot檢測p-tau(Ser262)在硒酸鈉組大鼠海馬組織中的表達變化，Timm染色檢測硒酸鈉組大鼠海馬苔蘚纖維出芽的動態(tài)變化;
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化及Western blot均顯示硒酸鈉組大鼠海馬p-tau(Ser262)表達水平于各檢測時間點均較同時間點空白對照組顯著下