腸炎沙門氏菌種特異性FQ-PCR建立及在闡明其侵染機制研究中的應用.pdf

1、本研究分為三部分： 1.舾種特異性FQ-PCR方法的建立 腸炎沙門氏菌(Sallmonellaenteritidis，SE)感染是一種重要的人畜共患病，本文根據GenBank登錄的SE種特異性DNA序列，設計合成了一對能特異性擴增130bpDNA片段的引物及相應的TaqMan探針，首次建立了SE種特異性的實時熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)診斷方法。該方法只能特異性擴增SE，而對豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲型

2、副傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、鴨沙門氏菌、雞沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、禽多殺性巴氏桿菌、鴨源大腸桿菌等常見沙門氏菌和常見感染鴨的致病菌的擴增結果均為陰性；該法建立的標準曲線為Y=-3.389X+44.276，相關系數為1.000，PCR循環(huán)效率為97.3％；檢測SE標準DNA模板的靈敏度為4copies/μL，檢測SE細菌數的敏感性為6CFU/μL，重復性差異系數為1.8％。分別應用該技術和傳統細菌分離法檢測人工感染死

3、亡雛鴨的心、肝、腦和直腸糞便，結果顯示兩種方法對心、肝、直腸糞便的陽性檢測結果符合率為100％，而FQ-PCR對腦的陽性檢測率極顯著(P＜0.01)高于細菌分離。研究結果表明，該方法快速、靈敏、特異、重復性好且能實時定量檢測，可用于SE分離鑒定、SE感染疑似病例檢測、SE體內動態(tài)分布規(guī)律研究及其分子流行病學調查。 2.在SE實驗感染雛鴨侵染機制研究中的應用 應用建立的FO-PCR方法對經皮下、口服和滴鼻途經人工感染SE雛

4、鴨組織器官的檢測結果表明： 經皮下接種該菌后最早可在2h內從血液中檢測到，4h能在心、肝和脾中檢測到；8h在腎、空腸和回腸檢測到陽性結果；12h除胸腺呈陰性外，其余組織均為陽性；24-36h之間各組織器官均能檢測到SE且含菌量達到最高，統計顯示，心、肝臟、脾臟、腎臟、回腸、空腸和盲腸的陽性拷貝數高于其它部位3-6個數量級，差異極顯著；皮下感染的雛鴨在36h后全部死亡。 通過口服接種結果顯示，8h在空腸和回腸最早被檢測到，

5、12h可在除肺、胰、法氏囊、胸腺、腦外的所有組織器官中被檢測到，但拷貝數低于皮下組1-2個數量級；24h腦組織開始出現陽性結果；24-36h后全部被檢組織器官呈陽性反應且達到最高峰；同樣地，心、血、肝臟、脾臟、腎臟、回腸、空腸和盲腸的陽性拷貝數明顯高于其它部位。48h后含菌量開始下降2-3個數量級或不能被檢測到陽性結果，然而該菌能在脾、空腸、回腸和盲腸中持續(xù)到9d仍能被檢測到。 滴鼻組中感染鴨SE的DNA拷貝數顯著低于前兩種感染

6、途徑。2h在肺中最早檢測到，4h后能在血液中被檢測到，8h心、肝、脾也呈陽性反應；12h除胸腺、食道、腦外均呈陽性反應；24h腦開始出現陽性結果；36h后能在所有樣品中檢測到并達到高峰，但其陽性拷貝數顯著低于前兩種接種方式。9d后，只能在脾臟、空腸、回腸和盲腸檢測到SE。 3.在SE實驗感染小鼠侵染機制研究中的應用 通過口服感染結果顯示，8h在空腸和回腸最早被檢測到，12h可在除肺、胰、腦外的所有組織器官中被檢測到，但拷

7、貝數低于皮下組1-2個數量級；24h腦組織開始出現陽性結果；24-36h后全部被檢組織器官呈陽性反應且達到最高峰；同樣地，心、血、肝臟、脾臟、腎臟、回腸、空腸和盲腸的陽性拷貝數明顯高于其它部位。48h后含菌量開始下降1-2個數量級或不能被檢測到陽性結果，然而該菌能在脾、空腸、回腸和盲腸中持續(xù)到9d仍能被檢測到。 SE經三種途徑感染后的共同特點是：腸道中以空腸和回腸的含菌量最高，且能持續(xù)存在9d而不被機體清除；主要內臟器官中以肝、