SDF-1及其受體CXCR4在哮喘大鼠肺組織中的表達及AMD3100的干預作用.pdf

1、支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組份參與形成的慢性氣道炎癥。其病因和發(fā)病機制尚未完全清楚,共同病理特征為氣道炎癥、氣道高反應性及氣道重塑。糖皮質激素的長期應用,極大地緩解了哮喘病人的臨床癥狀,生存質量得到了明顯提高,成為哮喘治療的經典用藥。但由于長期應用糖皮質激素,會伴隨一系列的副作用和依賴性,促使人們尋找另外方法治療哮喘。隨著分子生物學研究的進步,逐漸認識到趨化因子及其受體在炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現,CXC型趨化因子,基質細胞

2、衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF—1)和其特異性受體(CXC chemokine receptor4,CXCR4)所形成的生物軸,在T淋巴細胞的活化與遷移、HIV致病機制、血管新生與重建、腫瘤轉移、腦部發(fā)育、血細胞形成等多方面中均扮演重要角色。最近的研究顯示,SDF-1／CXCR4在哮喘發(fā)病中起到了重要作用,同時在小鼠哮喘模型中發(fā)現,霧化吸入糖皮質激素布地奈德后,SDF-1／CXCR4在肺

3、組織表達量降低。本實驗參照既往的方法加以改進,建立了大鼠哮喘模型。通過霧化吸入SDF-1／CXCR4特異性受體拮抗劑AMD3100進行干預,來探討SDF-1／CXCR4在哮喘發(fā)病過程中作用機制,為哮喘治療尋求新的思路。
　　 目的：本實驗通過建立大鼠哮喘模型,探討SDF-1／CXCR4在哮喘大鼠肺組織中的表達,及其特異性受體拮抗劑AMD3100干預的作用機制。
　　 材料和方法：
　　 1.動物分組及模型制作方法

4、雌性SD大鼠,健康清潔級,1月齡,體重100～120g,30只。隨機分組為對照組、哮喘組和干預組,每組10只。哮喘組大鼠分別于第1、8、15天腹腔內注射10％卵白蛋白(ovalbumin,OVA)與氫氧化鋁混懸液1ml致敏,從第16天始激發(fā),應用1％卵白蛋白與氫氧化鋁混懸液壓力霧化吸入,每次30分鐘,隔日激發(fā)1次,共激發(fā)20次；干預組以相同方法致敏和激發(fā),在激發(fā)第11次時開始于激發(fā)前30分鐘,分別給予霧化吸入AMD310050μg／只大

5、鼠的量,隔日1次,共10次；對照組腹腔注射及霧化均給予等量的生理鹽水代替,方法同哮喘組。
　　 2.標本處理
　　 三組大鼠分別在末次激發(fā)后24小時內,用苯巴比妥鈉腹腔注射100mg／只,麻醉后迅速給予開胸,取出右側肺組織,快速放置于液氮中凍存,留作RT-PCR及酶聯免疫吸附試驗用。取出左肺組織,置于4％甲醛溶液中,固定24小時后,酒精梯度脫水,并石蠟包埋,選取平行及垂直氣道兩方向切片,厚度約為5μm,行蘇木素-伊紅(H

6、E)染色。
　　 3.氣道壁厚度測量:
　　 HE染色切片上,選取完整氣道橫斷面。每張切片找出2個直徑約為2mm完整的同級別支氣管,應用計算機圖像分析系統(tǒng),分別以總管壁面積與支氣管基底膜周徑的比值,代表相應的管壁層厚度。
　　 4.酶聯免疫吸附法(ELISA):
　　 應用大鼠IL-4、IL-5 ELISA試劑盒測定肺組織勻漿中IL-4、IL-5的含量。于波長為450nm的酶標儀上,讀取各孔的吸光度OD值

7、。以OD值為縱坐標(Y),相應IL-4、IL-5的標準品含量為橫坐標(X),取得相應的曲線。樣品的IL-4、IL-5含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應含量。
　　 5.RT-PCR.
　　 將液氮凍存的右肺組織應用Trizol一步提取法,提取總RNA。反轉錄成cDNA,設計引物并擴增目的基因片段。擴增后的目的基因行瓊脂糖凝膠電泳。使用凝膠分析軟件Band Scan5.0,分別測定SDF-1、CXCR4與內參的灰度值,

8、以SDF-1、CXCR4與內參的比值來作為該大鼠的代表值。
　　 6.統(tǒng)計學方法
　　 用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行數據分析,計量資料應用平均數±標準差((x)±s)來表示。三組的數據之間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較應用LSD-t方法檢驗,兩個因素之間相關性采用pearson相關分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.一般情況
　　 大鼠經卵白蛋白與氫氧化鋁混

9、懸液致敏及激發(fā)后,可出現不同程度煩躁不安、呼吸加快、俯臥不動、趴于容器壁、腹肌扇動等表現。
　　 2.病理學改變
　　 在高倍鏡下觀察,在哮喘組可見大鼠的氣道上皮細胞脫落,粘液分泌物增多,黏膜下層及管壁周圍炎性細胞浸潤,黏膜下層及固有層可見血管增生和血管擴張,平滑肌層增厚,整個氣道壁增厚和管腔變形狹窄。支氣管壁周圍血管可見擴張、增厚。經干預后,可在干預組中上述改變減輕,而對照組中幾乎無上述改變。
　　 氣道壁厚度

10、在哮喘組(47.07±5.381)明顯較對照組(38.52±4.155)升高(P<0.05),干預組(42.77±4.033)氣道壁厚度明顯低于哮喘組(P<0.05)。
　　 3.肺組織勻漿中IL4、IL-5含量比較與對照組相比哮喘組中IL4、IL-5在肺組織勻漿中含量均明顯升高,經干預后可見降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.RT-PCR結果SDF-1mRNA表達量在哮喘組(0.43±0.040)中明

11、顯高于對照組(0.203±0.042),而干預組(0.379±0.048)中可見表達量相對減少,P<0.05。CXCR4mRNA表達量在哮喘組(0.441±0.064)中明顯高于對照組(0.260±0.036),而干預組(0.375±0.030)中可見表達量相對減少,P<0.05。
　　 5.相關性分析
　　 SDF-1mRNA表達量與氣道壁厚度呈正相關(r=0.647,P<0.05)；與IL-4、IL-5呈正相關,分別

12、為(r=0.530,P<0.05)；(r=0.559,P<0.05)CXCR4mRNA表達量與氣道壁厚度呈正相關(r=0.486,P<0.05)；與IL-4、IL5呈正相關,分別為(r=0.487,P<0.05)；(r=0.607,P<0.05)
　　 結論：
　　 (1)SDF—1及其受體CXCR4參與了哮喘大鼠氣道炎癥反應和氣道重塑過程。
　　 (2)AMD3100能夠改善哮喘大鼠的氣道炎癥和氣道重塑,與拮抗