高脂、炎癥狀態(tài)下Api6在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：凋亡抑制因子6(Apoptosis Inhibitor6,Api6)也叫作AIM或Spot,是清道夫受體富含半胱氨酸殘基家族新成員,在免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用；但作為清道夫受體,Api6在脂質(zhì)代謝中的作用尚未得到深入研究。本研究選用人THP-1單核/巨噬細(xì)胞和小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞探討①高脂、炎癥狀態(tài)下,兩種巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積情況；②高脂和/或炎癥狀態(tài)下,清道夫受體SR-A、CD36和Api6在兩種巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

2、；③高脂和/或炎癥狀態(tài)下,核受體LXRalpha.LXRbeta表達(dá)與Api6表達(dá)的相關(guān)關(guān)系。
　　 方法：⑴從人新鮮血漿中提取LDL,氧化制備成oxLDL；采用oxLDL刺激細(xì)胞建立高脂模型,采用脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞建立炎癥模型,油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積情況。⑵提取Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞mRNA,逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得Api6cDNA全長,構(gòu)建入pCDNA3.1質(zhì)粒中,獲得可以表達(dá).Api6基因的質(zhì)粒pCDNA3.1/

3、Api6。⑶實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR)檢測Api6、CD36、SR-A、LXRalpha、LXRbeta、ABCA1、ABCG1等基因在各種處理條件下,兩種巨噬細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①研究發(fā)現(xiàn)200 ng/ml的LPS和100μg/ml的oxLDL處理可以導(dǎo)致體外培養(yǎng)的兩種巨噬細(xì)胞出現(xiàn)異常的脂質(zhì)蓄積。②成功構(gòu)建了pCDNA3.1/Api6質(zhì)粒,并對RAW264

4、.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,使Api6表達(dá)上調(diào)了12500倍。③高脂情況下,清道夫受體SRA在RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中的表達(dá)分別上調(diào)了6倍、2.5倍和6倍、44倍。但同樣處理條件下,Api6在RAW264.7細(xì)胞的表達(dá)沒有明顯上調(diào)；而炎癥和高脂同時存在時,Api6在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)卻上調(diào)了2.7倍。④LXR受體激動劑T0901317可以使RAW264.7細(xì)胞中LXR的靶基因ABCA1和ABCG1基因表達(dá)分別上調(diào)22倍和

5、7倍；THP-1巨噬細(xì)胞中ABCA1和ABCG1基因表達(dá)均上調(diào)9倍；但LXR受體激動劑T0901317沒有改變Api6在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá),Api6在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)則上調(diào)了2倍。Api6在各種處理條件下表達(dá)水平的變化趨勢與L,XRa的表達(dá)水平相關(guān)。
　　 結(jié)論：200ng/ml的LPS和100μg/ml的oxLDL處理可以導(dǎo)致體外培養(yǎng)的RAW264.7和THP-1細(xì)胞出現(xiàn)異常的脂質(zhì)蓄積。炎癥、高脂狀態(tài)下,Api