苧麻轉抗旱基因的功能評估及抗旱轉錄組研究.pdf

1、苧麻是中國重要的天然纖維作物之一，且被廣泛種植在印度和其他東南亞和環(huán)太平洋國家。苧麻的生物產量比較高，長江流域一年可收獲三季，在雨水充足的菲律賓地區(qū)甚至可以收獲六季。由于研究起點較低、研究人員缺乏等原因，在GenBank中注冊的苧麻EST序列僅421條（截至2015年4月9日），且缺乏可參考的基因組圖譜信息。生物學信息的缺乏，嚴重阻礙了苧麻分子生物學的發(fā)展。本文利用轉錄組測序技術，鑒定到了一些抗旱相關的轉錄因子。通過建立的試管苗葉脈的遺

2、傳轉化體系。轉化了一個水稻干旱脅迫響應的NAC家族的轉錄因子SNAC1，進行了轉錄因子功能的驗證。并且對抗旱材料進行了組學研究。本文的主要結果如下:
　　1.采用“華苧5號”試管苗為實驗材料，首次以試管苗葉脈為外植體建立一個高效的根癌農桿菌介導的苧麻遺傳轉化體系。然后測定了葉脈再生對卡那霉素的敏感性，篩選出葉脈遺傳轉化過程中選擇培養(yǎng)時最佳卡那霉素濃度為40 mgL-1。
　　2.優(yōu)化了“華苧5號”葉脈遺傳轉化過程中影響轉化的

3、一些因素:葉齡、農桿菌濃度、共培養(yǎng)時間、農桿菌浸染時間以及共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的濃度。得到產生最高遺傳轉化效率的具體條件為:以取自40 d試管苗苗齡的葉脈為外植體，農桿菌菌液濃度OD600值為0.6，菌液浸染時間為10min，共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中乙酰丁香酮濃度為50 mg L-1，共培養(yǎng)時間為3d。以上條件能夠達到的平均轉化效率為23.25％。利用GUS和NPTⅡ基因的特異性引物進行的PCR檢測、Southern雜交檢測、GUS染色組

4、織化學分析等進一步證明了目的基因整合到苧麻基因組并在轉基因苧麻中得到表達。
　　3.利用已建立的苧麻葉脈遺傳轉化體系，轉化了一個水稻NAC(NAM，ATAFand CUC2)家族的SNAC1基因。對SNA C1基因不同轉基因家系進行PCR檢測。隨機選擇轉基因株系1，3，18和20做Southern拷貝數(shù)分析，檢測結果顯示SNAC1轉基因株系1，3和18為單拷貝的，轉基因株系20是雙拷貝的，隨機選擇轉基因株系3和20做后續(xù)的分析。熒

5、光定量結果表達分析證明，與對照相比，轉基因株系3和20目的基因均過量表達。
　　4.對轉基因株系3和20三個生長時期即苗期，旺長期和纖維成熟期的植株做了抗逆性分析。苗期采用10％(w/v) PEG6000模擬干旱脅迫，對照組是培養(yǎng)在1/2的霍格蘭營養(yǎng)液中。苗期抗逆性分析結果顯示轉基因株系3和20在干旱脅迫處理條件下，鮮重和干重明顯的高于野生型。旺長期實驗材料的干旱脅迫方法采用飽和灌溉，然后去除多余的水，抑制澆水，進而觀察植株的表型

6、。實驗結果表明，旺長期脅迫后，轉基因家系比野生型植株的凈光合速率、葉片相對含水量、脯氨酸、POD活性高，而丙二醛的含量則較低。干旱脅迫纖維成熟期的材料，其地上部分鮮重、鮮莖重、鮮皮重、干皮重，均比野生型植株高。綜上所述，轉基因植株比野生型植株具有較強的抗旱性。
　　5.本項研究中，對干旱脅迫的“華苧5號”利用15％(w/v) PEG6000進行干旱脅迫。對處理(0h,12h,24h,48和72h)的葉片進行葉片相對含水量、脯氨酸、

7、丙二醛和POD活性測定。根據這些生理指標的變化規(guī)律分析，選擇干旱脅迫處理0h,24h和72h的葉片和根提取RNA。獲取cDNA集合，并利用Illumina配對末端測序技術對其進行轉錄組分析，從而產生1.7億個原始測序讀長。在經PEG處理24h（L2和R2）和72h（L3和R3）的葉和根中共有16，798個基因差異性表達，其中，葉片中有9，281個，根中有8，627個。在這些基因中，來自AP2(3)、MYB(6)、NAC(9)、zinc