鴨RIG-I在免疫調節(jié)中的作用及分子調控機制.pdf

1、近年來，禽流感特別是高致病性禽流感給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性的打擊，并引發(fā)一系列的公共衛(wèi)生安全問題。雞、鴨同為家禽，對流感病毒有著不同的敏感性，這與宿主本身抗性基因和免疫相關基因的表達調控存在著密切的關系。維甲酸誘導基因Ⅰ(Retinoic acidinducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)能識別流感病毒并觸發(fā)先天性免疫，該基因在雞基因組上缺失，鴨基因組中保留，這種缺失使得雞與其他禽類相比對禽流感病毒更易感、臨床癥狀更明顯。但到目前為止，鴨R

2、IG-I是如何發(fā)揮抗病毒作用尚不清楚。
　　本實驗嘗試從不同角度闡釋鴨RIG-Ⅰ在免疫調節(jié)中的作用及分子調控機制，旨在揭示duRIG-Ⅰ在抗病毒先天性免疫信號傳遞途徑及其代償機制，并以期進一步完善雞體內抗病毒先天性免疫途徑及禽類免疫系統(tǒng)相關的基礎研究。主要研究內容如下:
　　1.為探討duRIG-Ⅰ基因的功能，首先克隆獲得了duRIG-Ⅰ eDNA序列，提交GenBank（登錄號為JQ946323.2和KC869660.1）

3、，發(fā)現(xiàn)了3'UTR存在可變剪接體;間接免疫熒光方法檢測結果顯示duRIG-Ⅰ蛋白主要位于細胞質，其次位于細胞核，進一步證實了該蛋白為胞質受體;半定量RT-PCR檢測結果顯示duRIG-Ⅰ在心、肝、腎、腺胃、大腸、小腸、肌肉、胸腺和下丘腦等組織的本底表達均處于較低水平，僅在脾臟和肺臟組織中有少量表達;進一步采用poly[I:C]模擬病毒感染，實時定量PCR檢測感染96 h內的脾臟和肝臟中的duRIG-Ⅰ基因的mRNA動態(tài)表達變化，發(fā)現(xiàn)感染

4、8h后脾臟和肝臟中duRIG-Ⅰ基因表達量均顯著上升（P＜0.05）。
　　2.基于上述duRIG-Ⅰ基因呈誘導性表達的特點，我們開展了duRIG-Ⅰ表達調控研究。首先克隆了duRIG-Ⅰ啟動子區(qū)，在線預測發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)存在一個明顯的CpG島，但BSP進一步檢測結果顯示，脾臟等中RIG-Ⅰ啟動子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測duRIG-Ⅰ基因啟動子轉錄活性結果顯示，在+14～-301 bp存在正調控，

5、該區(qū)的轉錄因子結合位點預測結果表明，IRF1等反式作用因子可能起著重要作用。
　　3.為了證實duRIG-Ⅰ的激活機制，對duRIG-Ⅰ進行保守結構域預測，發(fā)現(xiàn)duRIG-Ⅰ基因具有RLRs家族的典型特征（包括CARD結構域、RNA解旋酶等功能結構域），據(jù)此構建了不同結構域缺失突變體的表達載體，經(jīng)RT-PCR、間接免疫熒光和Western blot方法鑒定重組質粒的表達，利用RT-qPCR檢測結果發(fā)現(xiàn)CARD結構域能介導RLR通路

6、上IFN-β、Mxl及PKR基因的表達顯著上調;進一步采用NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)和ELISA檢測poly[I:C]介導的IFN-β的表達量，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)poly[I:C]誘導，duRIG-Ⅰ被顯著激活，同時CARDs結構域能夠通過激活NF-κB促使IFN-β的產生。
　　4.為進一步探索duRIG-Ⅰ基因在抗病毒先天性免疫中的作用，慢病毒介導的duRIG-Ⅰ基因在DF-1細胞中持續(xù)穩(wěn)定高表達，獲得了穩(wěn)轉細胞株DF-1/LV5-R

7、IG-Ⅰ和DF-I/LV5，并用RT-PCR及Western Blot驗證duRIG-Ⅰ基因mRNA水平和蛋白水平的表達情況，為下一步研究提供了細胞模型。
　　5.為探索duRIG-I在抗病毒先天性免疫信號傳遞途徑及其代償機制，我們利用5'ppp-dsRNA模擬病毒感染，進行RNA-seq，共篩選出278個差異基因（duRIG-Ⅰ基因介導的應答基因），其中120個差異基因被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，富集分析最可靠的通路為RIG-Ⅰ樣

8、受體信號通路;GO二級功能的富集分析主要富集在Ⅰ型干擾素信號通路、T細胞介導的細胞毒性正向調控、β干擾素的細胞應答、RIG-Ⅰ信號通路的正向調控等條目;通過Cytoscape軟件，基于通路上共有的差異基因，構建了RIG-Ⅰ信號通路與其他信號通路交聯(lián)的關系網(wǎng)路圖，推測Jak-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體關聯(lián)、Wnt信號通路、泛素介導的蛋白水解作用、MAPK信號通路等在抗病毒信號轉導過程中可能與RIG-Ⅰ