棉花雄性不育及黃萎病菌誘導相關microRNA的表達分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類在真核生物體內普遍存在的、長度約為19～25nt的內源性非編碼單鏈小RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為基因表達中的一類負調控子，不僅能夠調控植物花器官的發(fā)育，而且在植物感受逆境脅迫而做出適應性調整的過程中也發(fā)揮著重要的作用。因此探討miRNAs在雄性不育和抗黃萎病中的調控機制，可以為雄性不育在棉花雜種優(yōu)勢上的利用和棉花抗病育種提供新的途徑。
　　本研究利用miRNA芯片、高通量測序和實驗驗證

2、相結合的方法，鑒定棉花中的miRNAs及其靶基因，探討這些miRNAs在雄性不育和抗黃萎病中的調控機制。分析雄性不育相關以及脅迫誘導條件下棉花miRNA的差異表達情況，探討差異表達miRNA在花粉發(fā)育過程和抗逆反應中所起的作用，為闡明棉花雄性不育的分子機理和抗黃萎病的調控途徑提供參考。主要結果如下:
　　1.通過比較不育株和可育株花器官形態(tài)發(fā)現(xiàn)，不育株花較小，雄蕊花絲極短、花藥不開裂，花粉完全敗育。在普通生物顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不育株

3、花粉在花粉母細胞的減數(shù)分裂時期出現(xiàn)異常，單核期開始出現(xiàn)大量小孢子裂解，花藥發(fā)育的全過程中均出現(xiàn)了小孢子裂解現(xiàn)象。
　　2.分別提取不育株和可育株花粉造孢細胞時期、花粉母細胞時期和花粉粒時期花蕾RNA進行microRNA芯片雜交試驗，結果顯示，在不育株花粉發(fā)育的三個時期，分別檢測到407、369、401條miRNAs，在可育株花粉發(fā)育的三個時期，分別檢測到146、286、343條miRNAs。其中，有54條miRNAs在不育株和可育

4、株花粉中達到了顯著差異表達水平。另外，利用生物信息學方法預測得到35個miRNA的靶基因，其中大多數(shù)靶基因屬于轉錄因子，它們可能在花粉發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調控作用。
　　3.為了檢測miRNA的靶基因在轉錄水平上的表達狀況，利用Solexa測序對棉花“21A”不育株和可育株花粉母細胞時期花蕾進行基因表達譜分析，我們共得到1，742條顯著差異表達的基因，其中有12個轉錄因子參與到花粉發(fā)育。通過對差異表達基因的途徑顯著性富集分析，鑒

5、定了差異表達基因參與花粉發(fā)育過程中的主要代謝途徑，例如，戊糖和葡萄糖醛酸酯轉換途徑、類單萜類生物合成途徑、、倍半萜類生物合成途徑、淀粉蔗糖代謝途徑、半乳糖苷酶代謝途徑、亞麻酸代謝途徑、過氧物酶體代謝途徑等。miR159、miR319、miR172等家族miRNAs的靶基因（MYB、AP2等）在轉錄水平上出現(xiàn)顯著差異表達，它們可能參與了基因轉錄、激素信號轉導等代謝調控途徑。
　　4.為了研究雄性不育相關miRNA在抗病反應中的作用，

6、以高抗黃萎病品種海島棉7124和易感品種冀棉11為材料，對棉花進行黃萎病菌脅迫處理，利用高通量Solexa測序和生物信息學分析，鑒定得到140個已知miRNA和58個novel miRNA;篩選出了兩種棉花材料之間以及在不同處理條件下中差異表達的miRNA。共有26和19個miRNA在海島棉7124和冀棉11中受黃萎病菌侵染后誘導表達差異顯著，在正常生長和黃萎病菌浸染條件下，分別有35個和38個miRNA在兩種棉花栽培種之間表達量有顯著

7、差異。其中，在花粉發(fā)育過程中起重要調控作用的miR156、miR172、miR399、miR414等家族的miRNAs參與了棉花抗黃萎病反應過程。
　　5.以高抗黃萎病品種海島棉7124和易感品種冀棉11為材料，對棉花進行黃萎病菌脅迫處理，利用降解組測序測序方法，鑒定得到棉花中107個miRNAs的靶基因，其中，SBP and SPL transcription factor、NAC domain-containing prote

8、in、ClassⅢ HD-Zipprotein、AP2-1ike factor、F-box/RNI-like superfamily protein和growth-regulating factor(GRF)、MYB轉錄因子、leucine-rich repeat(LRR)-containing protein和LRR and NB-ARCdomain-containing disease resistance-like protein