攜帶HLA-G慢病毒轉染大鼠原代培養(yǎng)肝細胞及對抗大鼠肝移植排斥反應的研究.pdf

1、目的:人類白細胞抗原G(HLA-G)因為在母體胎兒之間的免疫耐受中發(fā)揮了關鍵性作用而被注意，提示它可能應用于器官移植。HLA-G在體外誘導表達已被證實有誘導免疫耐受的特性，移植術后患者體內(nèi)HLA-G的表達已被證實與移植術后急性和慢性排斥反應發(fā)生率降低有關。我們使用轉染攜帶人HLA-G基因的慢病毒轉染大鼠原代培養(yǎng)肝細胞及大鼠移植肝臟，在體外及在體條件下探討HLA-G的表達是否有直接保護移植肝臟免受排斥反應損傷的效果。
　　方法:

2、r>　　1、取260只健康雄性SD大鼠，分三個階段進行，先建立大鼠原位肝移植模型的手術訓練和探索。手術熟練后，取40只SD大鼠和40只Wistar大鼠，建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反應模型。
　　2、建立攜帶HLA-G的慢病毒表達體系。
　　3、進行SD大鼠肝細胞原代培養(yǎng)。
　　4、將攜帶人HLA-G的慢病毒轉染SD大鼠原代培養(yǎng)肝細胞，轉染后7天，通過免疫熒光、RT-PCR和Western Blot實驗

3、進行檢測，分別從病毒轉染、mRNA水平和蛋白水平全面評價HLA-G慢病毒轉染的效果。
　　5、采用kamada二套管法建立SD和Wistar大鼠的原位肝移植模型45例，隨機分為三組，每組15例。實驗組在SD大鼠的供體肝臟取下后，從門靜脈輸注2ml包含有107TU/ml攜帶HLA-G基因的慢病毒，將攜帶人HLA-G的慢病毒轉染大鼠供肝，與不加任何處理的對照組和術后規(guī)律使用FK506的對照組進行對比，對比術后三組肝組織中的HLA-G的

4、表達水平、術后第7天、第14天和第56天的AST和BIL值以及病理切片、術后生存天數(shù)。探討攜帶HLA-G基因的慢病毒轉染供肝，是否可對抗大鼠急性肝移植排斥反應。
　　結果:
　　1、經(jīng)訓練，成功建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反應模型。
　　2、攜帶人HLA-G的慢病毒可成功轉染SD大鼠原代培養(yǎng)肝細胞。
　　3、轉染攜帶有HLA-G慢病毒的實驗組術后7天大鼠的AST和BIL值，與術后使用FK506的對

5、照組差別有顯著性(P＜0.05)，與術后不加處理的對照組差別有極顯著性（P＜0.01）。轉染攜帶有HLA-G慢病毒的實驗組術后12天、56天大鼠的AST和BIL值，與術后使用FK506的對照組差別有顯著性（P＜0.01）;轉染攜帶有HLA-G的實驗組的AST和BIL值，與術后不加處理的對照組差別有極顯著性（P＜0.01）。對照組中位生存時間12.00天，F(xiàn)K506組中位生存時間70.50天， HLA-G組中位生存時間91.50天，各組之

6、間差別有顯著性（P＜0.01）。提示這種治療可延長受體大鼠的存活期。病理切片結果顯示，轉染攜帶有HLA-G慢病毒的實驗組和術后使用FK506的陽性對照組，術后7天病理切片僅有輕度排斥反應，而術后不加任何處理的陰性對照組則顯示為重度排斥反應。術后56天，F(xiàn)K506組病理切片顯示存在輕度排斥反應，而HLA-G組無排斥反應。
　　結論:
　　1、轉染攜帶有HLA-G慢病毒作為治療性的手段用于大鼠肝移植急性排斥反應模型，能有效保護大